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为解决组蛋白传递异常的相关问题，研究人员开展了组蛋白回收机制及影响的研究。结果发现破坏组蛋白回收影响染色质景观和细胞活力。这一成果对理解基因组调控和细胞分化意义重大，推荐科研读者阅读。
在生命的奇妙旅程中，细胞的分化与发育就像一场精心编排的舞蹈，每个细胞都在这场舞蹈中扮演着独特的角色，遵循着特定的规则，展现出各自的 “舞姿”。而在细胞的微观世界里，DNA 复制时染色质景观的恢复以及组蛋白的传递，就是这场舞蹈中至关重要的舞步，它们对于维持细胞的身份和正常功能起着关键作用。
多细胞生物的发育就像建造一座宏伟的大厦，需要通过特定的转录程序来塑造各种各样的细胞类型。尽管每个细胞都携带相同的基因组，但高度特化的细胞类型能够产生并维持，这在很大程度上得益于表观遗传调控。就好比大厦里不同功能的房间，虽然都在同一栋建筑里，但却有着各自独特的用途和装饰风格，这就是细胞的可塑性和记忆能力的神奇之处。在细胞分裂的过程中，染色质景观会被复制叉的通过所打乱，就像一阵风吹过，原本整齐排列的物品被弄乱了一样。亲代组蛋白在复制叉前被拆解，跨越复制体，然后在两条子代 DNA 链上重新组装成核小体。与此同时，新的乙酰化组蛋白也会沉积下来，以维持核小体的密度。亲代组蛋白及其翻译后修饰（PTMs）的回收是非常精确的，它们能保持位置信息，使亲代组蛋白在 DNA 前导链和后随链上大致对称分布。像组蛋白 H3 - H4 会以四聚体，甚至可能以六聚体的形式，与单个 H2A/H2B 二聚体一起进行回收。并且，复制体因子 Tof1/TIMELESS、微小染色体维持复合体组件 2（MCM2）、Ctf4 以及 DNA 聚合酶 α（POLA1）和 δ（POLD）对于后随链上高效的组蛋白回收是必需的，而 DNA 聚合酶 ε 亚基 POLE3/4 则有助于前导链上的组蛋白回收。此外，Mrc1/CLASPIN 还能调节组蛋白向两条子代链的回收。新组蛋白在新生染色质中的沉积会导致复制前组蛋白 PTM 水平稀释两倍，为了恢复复制前的染色质状态，新组蛋白会经历一个异质性的修饰过程，这个过程具有修饰和位点特异性的动力学特征，对于抑制性修饰来说，还会延伸到下一个细胞周期。在这个过程中，亲代组蛋白 PTMs 可以通过基于读写的扩散促进新组蛋白的修饰，这在抑制性修饰 H3K27me3 和 H3K9me3 中得到了充分的证明。
然而，目前仍有许多谜团等待解开。比如，在 MCM2 组蛋白结合突变体（MCM2 - 2A）中，亲代组蛋白主要被回收到前导链，导致姐妹染色单体之间的组蛋白 PTM 景观出现强烈不对称。在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，这种染色质状态的区域不对称性可以传递给子代细胞，突变的 mESCs 会出现染色质景观失调，主要影响 H3K27me3 和 H3K9me3，进而影响基因表达。虽然已知基于顺式的组蛋白修饰遗传对于表观基因组的维持是必要的，但如果亲代组蛋白在传递过程中丢失会发生什么，目前还知之甚少。而且，如果前导链和后随链的组蛋白回收途径都被阻断，又会出现什么情况呢？这就像是在一场比赛中，原本的规则被改变了，选手们会如何应对，比赛结果又会怎样呢？为了揭开这些谜团，研究人员踏上了探索之旅。
来自相关研究机构的研究人员在《Science Advances》期刊上发表了题为 “Disrupting histone recycling to both leading and lagging strands challenges chromatin landscape maintenance and cell viability” 的论文。他们发现，破坏组蛋白向两条链的回收会导致复制过程中亲代组蛋白的大量丢失，这会加剧 MCM2 - 2A 突变体中的基因表达和分化缺陷，还会挑战细胞的活力。同时，他们还揭示了 H3K27me3 的积累是对组蛋白回收受损的早期反应，并且早于基因表达的变化。这一发现对于理解基因组调控和细胞分化的机制具有重要意义，就像找到了一把解开细胞微观世界奥秘的新钥匙，为后续的研究开辟了新的道路。
在这项研究中，研究人员使用了多种技术方法来解开这些谜团。他们运用了诱导性突变体技术，通过构建可诱导的 POLE4 降解系统，研究前导链回收缺陷的初始影响，以及与 MCM2 - 2A 突变体中后随链回收缺陷相结合的影响。还使用了多种测序技术，如姐妹染色单体复制后测序（SCAR - sequencing）、复制后染色质占有率测序（qChOR - sequencing）、RNA 测序（RNA - seq）和复制转座酶可及染色质测序（repli - ATAC - seq），从不同角度分析组蛋白的回收、基因表达和染色质状态。此外，还利用了质谱（MS）分析来检测组蛋白 PTM 水平，以及高内涵显微镜技术来量化 H3K27me3 水平。这些技术就像研究人员手中的 “魔法工具”，帮助他们深入探索细胞的微观世界。
研究人员首先研究了不对称组蛋白回收对 H3K27me3 的直接影响。为了避免稳态突变带来的适应性和克隆变异问题，他们将前导链回收因子 POLE4 与降解标签（dTAG）融合，在 mESCs 中建立了一个可诱导的消耗系统。当加入 dTAG - 13 后，POLE4 能在 30 分钟内被有效消耗。通过 SCAR - sequencing 检测发现，短期消耗 POLE4 会导致以 H4K20me2 标记的亲代组蛋白出现适度不对称，偏向于后随链，同时新合成的以 H4K20me0 标记的组蛋白则偏向于前导链，这表明前导链上亲代组蛋白的减少被新组蛋白的增加所补偿。而通过 qChOR - sequencing 检测发现，POLE4 去除后，H3K27me3 的整体景观、总水平以及回收效率并没有改变，这说明亲代组蛋白只是从前导链重新路由到后随链，其基因组位置保持不变。虽然 24 小时的 POLE4 消耗没有检测到基因或重复表达的差异，但 96 小时的消耗后，基因表达出现了明显变化，且与 POLE4 - KO 细胞中的差异表达基因有很强的相关性。通过质谱分析发现，72 小时的 POLE4 消耗后，H3K27me3 水平增加，高内涵显微镜进一步证实了 H3K27me3 在 POLE4 消耗后逐渐积累，在 24 小时内显著增加。这一系列研究表明，H3K27me3 积累是对组蛋白回收不对称的早期反应，早于基因表达变化。
接着，研究人员探究了同时破坏前导链和后随链回收时亲代组蛋白的变化。他们在 MCM2 - 2A 突变体 mESCs 中引入 POLE4 - dTAG，通过 SCAR - sequencing 发现，MCM2 - 2A 突变体背景下亲代组蛋白传递到前导链的偏差在 POLE4 急性消耗后有所降低，但并未消失。qChOR - sequencing 结果显示，短期消耗 POLE4 在 MCM2 - 2A 细胞中没有显著改变回收准确性，但降低了亲代 H3K27me3 的回收效率，同时在新生染色质上回收的亲代 H3K36me3 和 H4K20me2 水平也降低，而总 H3 水平略有增加。此外，当 MCM2 和 POLE4 回收途径都受损时，H3K27me3 标记的组蛋白可以在游离组蛋白的可溶性池中被检测到，这表明亲代组蛋白在复制过程中丢失，尽管新组蛋白的沉积可能在一定程度上补偿了这种损失，但总体上同时破坏两条链的回收途径会损害亲代组蛋白转移到新合成 DNA 的效率。
随后，研究人员比较了单突变和双突变的表型，以了解它们遗传缺陷的后果。质谱分析表明，在 MCM2 - 2A 背景下 72 小时的 POLE4 消耗后，总组蛋白 H3 - H4、复制性组蛋白 H3.1 和替换变体 H3.3 以及新老组蛋白标记 H4K20me0 和 H4K20me2 的全球水平没有变化，但 H3K36me3 和 H3K27me3 的全球水平增加，高内涵显微镜证实了 H3K27me3 的逐渐增加。RNA - seq 结果显示，MCM2 - 2A 突变体与野生型相比，转录变化重现了之前的研究结果，包括二细胞样细胞（2CLC）基因的表达、双价基因的失调和重复抑制的丧失。24 小时的 POLE4 消耗在 MCM2 - 2A 背景下导致许多复制依赖性组蛋白基因下调，同时影响了形成性多能性因子的表达，96 小时的消耗则导致更多基因表达变化，包括 2CLC 基因和重复序列的上调，以及形成性多能性因子的持续下调。细胞活力测定表明，长期的 POLE4 消耗在 MCM2 - 2A 突变体中会损害细胞活力，而单独破坏任一途径则不会。这说明同时破坏两条链的回收途径对 mESCs 的基因表达有协同效应，与细胞状态转换受损有关，还会损害细胞活力。
最后，研究人员研究了突变体的分化能力。他们聚焦于体外向神经谱系分化的过程，通过全反式维甲酸（RA）诱导分化，并在分化前消耗 POLE4 24 小时，然后跟踪转录变化。主成分分析（PCA）显示，所有组蛋白回收突变体在分化的前 24 小时遵循相似的轨迹，但在 60 小时时出现分离，dPOLE4 MCM2 - 2A 细胞表现出最严重的缺陷。RNA - seq 分析表明，POLE4 消耗增加了差异表达基因的数量，这些基因在分化和发育过程中显著富集。在分化过程中，野生型细胞中长末端重复（LTR）家族和长散在核元件（LINE）的表达会下降，但在突变体中这些转录本在分化过程中未能沉默，同时突变体也无法关闭多能性网络，并且在早期分化反应中存在缺陷。此外，dPOLE4 MCM2 - 2A 细胞在 RA 诱导的分化过程中，细胞活力受到更严重的挑战。这表明同时破坏 POLE4 和 MCM2 回收途径会进一步损害重复序列沉默和向分化的表达程序的稳健和及时转换，影响细胞活力。
在讨论部分，研究人员总结了他们的研究成果。他们的诱导模型揭示了在野生型或 MCM2 - 2A 突变体背景下，急性干扰前导链组蛋白回收后的一系列事件。破坏 POLE4 和 MCM2 介导的回收途径会导致复制过程中亲代组蛋白的大量丢失，这会加剧 MCM2 - 2A 突变体中的基因表达和分化缺陷，甚至挑战细胞活力。H3K27me3 的积累是对组蛋白回收受损的早期反应，早于基因表达变化，这支持了复制后亲代组蛋白的总体丰度对表观基因组恢复很重要的观点，强调了亲代组蛋白回收在基因组调控和支持细胞特化转录程序中的关键作用。同时，他们还发现 dPOLE4 MCM2 - 2A 细胞在复制过程中亲代组蛋白丢失，这与之前在芽殖酵母中的研究一致，但与裂殖酵母中的情况不同，裂殖酵母中同时废除 POLE3/4 和 MCM2 依赖的组蛋白回收可以挽救单个突变体的沉默缺陷，这表明不同物种可能存在不同的补偿机制。此外，他们还探讨了 H3K27me3 积累的机制，认为缺乏亲代组蛋白的负反馈、DNA 结合机会增加以及 H3.3 沉积增加等因素共同促进了 H3K27me3 的异常积累。
这项研究就像一场精彩的冒险，研究人员通过巧妙的实验设计和多种技术手段，深入探索了组蛋白回收的奥秘。他们的发现为我们理解细胞分化和基因组调控提供了重要的线索，就像在黑暗中点亮了一盏明灯，让我们对细胞的微观世界有了更清晰的认识。未来，这些研究成果有望为发育生物学、再生医学等领域的发展提供理论基础，帮助我们更好地探索生命的奥秘，解决更多与细胞相关的难题。
