巨噬细胞中 LPS 诱导线粒体超氧化物的产生机制及对免疫调控的关键意义

为解决 LPS 诱导巨噬细胞线粒体超氧化物产生机制不明等问题，英国研究人员开展相关研究。结果发现其由反向电子传递驱动，且 RET 产生的 mtROS 调节 IL-1β 释放。该研究对理解巨噬细胞免疫功能意义重大，推荐一读。

　　

在人体的免疫系统中，巨噬细胞可是个 “大忙人”，它就像一个身兼数职的 “超级卫士”。一方面，当细菌等病原体入侵时，它会迅速响应，奋勇杀敌，通过产生各种物质来对抗感染；另一方面，在炎症反应结束后，它还得负责清理战场，促进组织的修复和再生。而在巨噬细胞对抗感染的众多 “武器” 中，线粒体衍生的活性氧（mtROS）是非常重要的一种，它不仅能直接杀灭细菌，还参与调节巨噬细胞细胞因子的产生，对免疫反应的进程有着深远影响。

不过，科学家们发现，虽然 mtROS 在巨噬细胞的免疫功能中作用巨大，但它的产生机制却像是一团迷雾，让人捉摸不透。其中，线粒体产生超氧化物的一个主要机制是电子传递链复合物 I 处的反向电子传递（RET） 。在正常情况下，复合物 I 会接受 NADH 的电子，并将质子泵出线粒体内膜，产生质子动力势（Δp），这个能量会驱动 ATP 的合成。然而，在某些特定条件下，电子也可以反向传递，从辅酶 Q（CoQ）池通过复合物 I，最终产生超氧化物。这一过程就像河流中的水，原本是顺流而下，现在却出现了逆流的情况。

当巨噬细胞受到脂多糖（LPS）刺激后，细胞内的代谢会发生剧烈变化，就像平静的湖面被投入了一颗巨石，泛起层层涟漪。其中，最为显著的变化是 ATP 的产生方式从氧化磷酸化转变为糖酵解，同时三羧酸循环中的琥珀酸也会大量积累。这些变化让科学家们猜测，RET 可能在 LPS 刺激的巨噬细胞中驱动了超氧化物的形成，但 mtROS 产生的具体模式和来源却并不明确，LPS 诱导的代谢重编程与 mtROS 产生之间的联系也如同隐藏在黑暗中的秘密，有待揭开。此外，升高的 mtROS 如何与琥珀酸和衣康酸等代谢信号协同调节促炎巨噬细胞的功能，同样是一个未解之谜。

为了弄清楚这些问题，来自英国的研究人员在《Nature Metabolism》期刊上发表了一篇名为 “LPS-induced mitochondrial superoxide production is driven by reverse electron transport in macrophages” 的论文。他们通过一系列实验，终于揭开了 mtROS 产生机制的神秘面纱。研究发现，LPS 刺激的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）通过 RET 在电子传递链复合物 I 处产生超氧化物。而且，这一过程是由 LPS 诱导的代谢重编程驱动的，代谢重编程增加了质子动力势（主要是线粒体膜电位 Δψ_m升高），并维持了 CoQ 池的还原状态。更重要的是，他们还发现 RET 产生的 mtROS 在 NLRP3 炎性小体激活过程中调节 IL-1β 的释放。这一研究成果就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为我们深入理解巨噬细胞的免疫功能和炎症反应机制提供了关键线索。

在这项研究中，研究人员运用了多种技术方法来探索 mtROS 的产生机制。他们使用了线粒体靶向探针 MitoNeoD，通过监测其被超氧化物氧化后的荧光信号变化，来精准测量 mtROS 的产生情况。在代谢物分析方面，运用了质谱技术，对细胞内的琥珀酸、衣康酸等代谢物进行提取和分析，以此了解细胞代谢的变化。此外，还利用基因工程技术构建了特殊的小鼠模型，如 ND6^P25L小鼠，这种小鼠的线粒体存在特定突变，无法通过 RET 产生 mtROS，这为研究 mtROS 在细胞功能中的作用提供了有力工具。

下面，让我们一起深入了解一下具体的研究结果。

1. 线粒体超氧化物产生的时间依赖性：为了确定 LPS 刺激的 BMDMs 中线粒体超氧化物的产生机制，研究人员选择了 MitoNeoD 探针来测量 mtROS 的产生。实验结果显示，LPS 刺激 24 小时的 BMDMs 中 MitoNeoOH（MitoNeoD 的氧化产物）的荧光强度，与用线粒体超氧化物生成剂 MitoParaquat（MitoPQ）急性处理后的荧光强度相当。进一步观察发现，随着 LPS 处理时间的延长，线粒体超氧化物的产生逐渐增加，到 24 小时时达到与急性 MitoPQ 处理相同的水平。在观察线粒体形态变化时，研究人员发现 LPS 刺激后，线粒体的形态发生了显著改变，从最初的点状逐渐变为丝状，而且线粒体的长度、面积以及每个网络的连接点都有所增加，但线粒体的数量却减少了，不过线粒体的质量并没有发生变化。这一系列变化表明，LPS 刺激后，线粒体超氧化物的产生与线粒体形态的改变是同步进行的。

2. LPS 刺激后的代谢重编程：研究人员接着对巨噬细胞在 LPS 刺激后的代谢变化展开研究。结果发现，LPS 处理后，线粒体呼吸作用减弱，糖酵解的细胞外酸化率升高，乳酸大量积累并分泌到细胞外。同时，细胞内的代谢酶也发生了变化，如己糖激酶 I 和丙酮酸脱氢酶的蛋白水平升高，丙酮酸激酶从 PKM1 型转变为 PKM2 型。此外，LPS 刺激还导致三羧酸循环和糖酵解途径的中间产物增加，其中琥珀酸和衣康酸的积累尤为明显。进一步研究发现，LPS 处理会使电子传递链和氧化磷酸化复合物的表达发生改变，复合物 I、III 和 IV 的表达下降，F₁F_O-ATP 合酶在 9 小时后也开始减少，而琥珀酸脱氢酶（SDH）亚基 A 的表达则保持稳定。这些代谢变化表明，LPS 刺激引发了巨噬细胞的代谢重编程，而这种重编程与线粒体超氧化物的产生以及线粒体功能的改变密切相关。

3. 膜电位升高驱动超氧化物产生：为了探究 LPS 刺激后线粒体超氧化物产生与代谢重编程之间的联系，研究人员测量了线粒体膜电位（Δψ_m）的变化。他们发现，随着 LPS 处理时间的增加，Δψ_m逐渐升高，在 24 小时时达到最大值。为了确定 F₁F_O-ATP 合酶在这一过程中的作用，研究人员用寡霉素处理细胞。结果发现，寡霉素处理非刺激的 BMDMs 会导致 Δψ_m大幅升高，同时诱导超氧化物的产生。这表明，细胞从氧化磷酸化产生 ATP 转变为糖酵解产生 ATP 的过程中，对 F₁F_O-ATP 合酶的依赖减少，从而使得质子动力势（Δp）增加，进而驱动了线粒体超氧化物的产生。

4. CoQ 池还原对超氧化物产生的必要性：由于呼吸链产生超氧化物需要还原的 CoQ 池，研究人员对 LPS 处理的 BMDMs 中 CoQ 池的氧化还原状态进行了测量。结果发现，LPS 处理后，线粒体 CoQ 的氧化还原状态并没有改变。为了进一步研究氧化的 CoQ 池对 LPS 诱导的线粒体超氧化物产生的影响，研究人员使用了表达交替氧化酶（AOX）的 BMDMs，AOX 可以氧化 CoQ 池。实验结果显示，AOX 表达会抑制 LPS 诱导的超氧化物产生，而用 AOX 抑制剂 n - 丙基没食子酸酯（n-PG）处理后，线粒体超氧化物的产生又恢复到了正常水平。此外，研究人员还发现，抑制琥珀酸氧化会导致 CoQ 池氧化，同时抑制 LPS 诱导的线粒体超氧化物产生。这表明，琥珀酸氧化对于维持 CoQ 池的还原状态、升高 Δψ_m以及驱动超氧化物产生至关重要。而且，研究人员在人巨噬细胞中也发现了类似的现象，这说明这种机制在不同物种中具有一定的保守性。

5. LPS 诱导的超氧化物由复合物 I 处的 RET 产生：线粒体超氧化物可以通过多种方式在线粒体电子传递链中产生，为了确定 LPS 诱导的超氧化物的产生位置，研究人员进行了一系列实验。他们发现，用鱼藤酮处理可以消除 LPS 处理后 MitoNeoOH 和 MitoSOX 荧光的增加，这表明线粒体超氧化物的产生与复合物 I 有关。为了进一步区分超氧化物是在复合物 III 产生还是在复合物 I 通过 RET 产生，研究人员使用了 ND6^P25L小鼠的 BMDMs，这种小鼠的线粒体无法通过 RET 产生超氧化物。实验结果显示，ND6^P25L小鼠的 BMDMs 在 LPS 刺激下不会产生超氧化物，而 MitoPQ 处理则可以诱导超氧化物的产生。这充分证明了 LPS 激活的巨噬细胞通过复合物 I 处的 RET 产生超氧化物，而这一过程是由升高的 Δψ_m和维持还原的 CoQ 池驱动的。

6. mtROS 对 LPS 诱导的细胞因子产生的调节作用：研究人员还关注了 mtROS 在细胞因子调节中的作用。他们发现，线粒体超氧化物、Δψ_m、琥珀酸和衣康酸的变化与细胞因子的产生在时间上存在一定的相关性。通过对野生型和 ND6^P25L小鼠的 BMDMs 进行研究，发现无法通过 RET 产生 mtROS 的 ND6^P25L小鼠，其 LPS 诱导的细胞因子产生并没有受到明显影响。在小鼠体内败血症模型中，野生型和 ND6^P25L小鼠在 LPS 处理 2 小时后的血清细胞因子水平也没有显著差异。这说明 mtROS 在 LPS 刺激的巨噬细胞中，对细胞因子的产生并没有起到关键的调节作用。

7. RET-ROS 对 IL-1β 释放的调节作用：mtROS 在 IL-1β 释放和 NLRP3 炎性小体激活中的作用一直存在争议，研究人员对此进行了深入研究。他们发现，在 LPS 刺激下，ND6^P25L小鼠的 BMDMs 中 Il1b 的转录水平下降，但 pro-IL-1β 和 NLRP3 的水平与野生型小鼠相当。进一步研究发现，在 NLRP3 炎性小体激活过程中，野生型 BMDMs 在 ATP 和尼日利亚菌素处理后，MitoNeoOH 荧光大幅增加，而 ND6^P25L小鼠的 BMDMs 则不会产生 mtROS，这表明 mtROS 是在 NLRP3 炎性小体激活过程中由 RET 产生的。而且，ND6^P25L小鼠的 BMDMs 在 NLRP3 炎性小体激活后，IL-1β 的释放减少，乳酸脱氢酶（LDH）的释放也降低，这说明 mtROS 通过 RET 产生的过程调节了 IL-1β 的释放和细胞焦亡。此外，研究人员还发现，mtROS 对 NLRP3 炎性小体的组装没有影响，但可能通过调节 GSDMD 的孔形成来影响 IL-1β 的释放和细胞焦亡。在体内实验中，研究人员通过腹腔注射单钠尿酸盐（MSU）晶体诱导小鼠腹膜炎模型，发现 ND6^P25L小鼠的中性粒细胞浸润减少，这进一步证明了 mtROS 通过 RET 产生的过程在体内对 NLRP3 炎性小体激活的调节作用。

总的来说，这项研究详细地揭示了 LPS 刺激后巨噬细胞代谢重编程的时间进程，明确了 mtROS 是由复合物 I 处的 RET 产生的。研究人员利用 ND6^P25L小鼠模型，成功区分了 mtROS 和代谢物在调节巨噬细胞细胞因子产生中的信号作用，发现 mtROS 通过 RET 产生的过程在 NLRP3 炎性小体激活后调节 IL-1β 的释放。虽然 mtROS 调节 IL-1β 释放的具体机制还需要进一步研究，但研究结果表明，mtROS 可能通过调节 GSDMD 的孔形成来发挥作用。此外，研究也没有排除其他氧化还原信号在调节炎性小体激活中的作用，不同的氧化还原信号可能在不同的情况下以不同的方式调节炎性小体的激活。

这项研究具有重要的意义。它不仅为我们理解巨噬细胞的免疫功能和炎症反应机制提供了新的视角，也为开发针对炎症相关疾病的治疗策略提供了潜在的靶点。比如，在一些炎症性疾病中，过度的炎症反应会对身体造成损害，如果能够精准调控 mtROS 的产生或者 NLRP3 炎性小体的激活，就有可能减轻炎症反应，为患者带来新的治疗希望。同时，研究中使用的工具和遗传模型，也为后续进一步研究线粒体功能和 mtROS 在免疫系统中的作用奠定了坚实的基础，让我们在探索人体免疫系统奥秘的道路上又前进了一大步。