Nature：GABA 能神经元与胶质瘤竟有这层 “隐秘关系”

为解决神经元活动影响胶质瘤进展机制不明，尤其是非谷氨酸介导的神经元 - 胶质瘤突触研究不足的问题，斯坦福大学研究人员开展 GABA 能神经元与 DMG 关系的研究，发现相关促瘤突触及机制。推荐阅读，助您了解脑癌研究新突破。

　　

在医学研究的广阔领域中，脑癌一直是令人头疼的难题，尤其是高级别胶质瘤（HGGs），它可是脑癌相关死亡的 “罪魁祸首”。HGGs 就像一个复杂的 “大拼盘”，包含了临床上、解剖学上和分子层面都各不相同的亚型，其中弥漫性中线胶质瘤（DMG）和半球性 HGGs 是比较典型的代表。DMG 这种病常常发生在孩子们身上，是一种极为致命的中枢神经系统癌症，治疗手段少得可怜，患者的中位生存期仅仅只有 11 - 13 个月，这就像一道沉重的阴影，笼罩在患者和家属的心头。

以前的研究发现，神经元活动和胶质瘤的发展之间有着千丝万缕的联系。神经元可以通过旁分泌信号，就像是细胞之间传递的 “小纸条”，来影响胶质瘤的进程。而且，神经元和胶质瘤细胞之间还存在着特殊的连接 —— 神经元 - 胶质瘤突触，这就好比是它们之间的 “秘密通道”，谷氨酸能 AMPA 受体依赖的突触在儿童和成人的高级别胶质瘤中都被证实存在。不过，除了谷氨酸之外，由其他神经递质介导的神经元 - 胶质瘤突触却很少有人研究，这就像是一片神秘的 “未知领域”，等待着科学家们去探索。

为了揭开这片 “未知领域” 的神秘面纱，来自斯坦福大学的研究人员们勇挑重担。他们在《Nature》期刊上发表了一篇名为 “GABAergic neuron-to-glioma synapses in diffuse midline gliomas” 的论文，为我们带来了令人惊喜的研究成果。他们发现，在 DMG 中存在着一种由 GABAA 受体介导的、能够促进肿瘤生长的功能性 GABA 能神经元 - 胶质瘤突触。而且，他们还发现 GABA 能神经元的活动会促进 DMG 在体内的增殖，常用药物苯二氮卓类药物劳拉西泮竟然会加速 DMG 的生长，缩短患者的生存期。这些发现就像一把把钥匙，为我们打开了理解脑癌神经生理学肿瘤亚型特异性机制的大门，对未来开发更有效的治疗方法有着重要的意义。

研究人员在探索的过程中，使用了好几种厉害的技术方法。他们运用全细胞膜片钳电生理学技术，就像是给细胞装上了一个 “电信号探测器”，来记录细胞的电活动；利用体内光遗传学技术，能够精准地控制神经元的活动，就像给神经元装上了一个 “开关”；还借助了患者来源的原位异种移植模型，让研究更贴近患者的实际情况，仿佛是在患者体内搭建了一个 “小型实验室”。

下面我们就来详细看看他们的研究结果。

GABA 受体基因在 DMG 中的表达

研究人员首先想知道，参与 GABA 能突触传递的基因在高级别胶质瘤中是否有表达。他们像侦探一样，仔细分析了单细胞 RNA 测序（RNA - seq）数据集，这个数据集就像是一个装满了细胞秘密的 “大宝库”。结果发现，H3K27M + DMG 细胞广泛表达 GABA 受体（GABAA）亚基基因，还有一些和 GABA 能突触后区相关的基因。而且，这些基因在 H3K27M + DMG 和 IDH 突变的高级别胶质瘤中的表达程度，要比在 IDH 野生型高级别胶质瘤中高得多。在对原发性患者活检样本进行单细胞转录组分析时，他们又有了新发现：GABA 能突触相关基因表达特征在所有恶性细胞区室中都存在，并且在 OPC 样细胞区室中更加丰富。这就好像 GABA 能突触相关基因在 DMG 细胞里特别 “活跃”，忙着搞各种 “小动作”。此外，H3K27M + DMG 单细胞在 GABA 能突触相关基因表达上存在着个体差异和个体内差异，不过所有患者的肿瘤都在不同程度上表达这些基因。H3K27M + DMGs 还相对较高地表达 GABAA 受体亚基 α3、β3 和 γ 亚基，以及氯离子转运体 NKCC1。这些发现为后续的研究打下了坚实的基础，就像是在沙滩上打下了牢固的 “地基”。

结构性 GABA 能 DMG 突触

找到了基因表达的线索后，研究人员接着想亲眼看看 GABA 能神经元和 DMG 肿瘤细胞之间的突触长什么样。他们采用了多种巧妙的方法。第一种方法，他们把编码带有 GFP 标签的 GABRG2 的构建体，导入患者来源的 DMG 肿瘤细胞中，然后把这些细胞移植到小鼠的海马体中，8 周后通过免疫电子显微镜来观察。这就好比给突触贴上了一个 “绿色的小标签”，方便在显微镜下寻找它们的踪迹。第二种方法，他们把表达 GABRG2 - GFP 的患者来源的 DMG 细胞，和混合的 GABA 能及谷氨酸能小鼠神经元一起培养，再通过免疫细胞化学和共聚焦显微镜来观察。这就像是把细胞们放在一个 “大培养皿实验室” 里，看看它们之间会有什么 “互动”。第三种方法，他们在 GABA 能中间神经元中表达 mCherry，再把表达细胞质 GFP 的患者来源的 DMG 细胞移植到小鼠海马体中，通过免疫组织化学和共聚焦显微镜观察。这三种方法就像三把不同的 “钥匙”，都成功证明了 GABA 能中间神经元和患者来源的 DMG 细胞之间存在结构性 GABA 能突触。而且，通过量化分析，他们发现大约 20% 的胶质瘤细胞 gephyrin 斑点与突触前 VGAT 共定位，这让我们对这些突触的结构有了更清晰的认识。

功能性 GABA 能 DMG 突触

确定了突触的结构后，研究人员又开始琢磨这些突触有没有功能。他们把表达 GFP 的胶质瘤细胞移植到小鼠海马体的 CA1 区域，然后用全细胞膜片钳电生理学技术，记录 DMG 细胞对局部神经元低强度电刺激的反应。为了排除其他干扰，他们还使用了 AMPA 受体拮抗剂 NBQX 来阻断 AMPA 受体介导的谷氨酸能神经元 - 胶质瘤突触。结果发现，在大约 40% 的 DMG 细胞中观察到了与 GABA 能突触反应一致的内向电流，这些电流的上升时间、衰减时间和反应潜伏期都有特定的值，而且与单细胞 RNA - seq 数据显示的最高度表达的 GABA 亚基相符合。这些 GABA 能电流是由神经元动作电位引起的，因为电压门控钠通道阻滞剂河豚毒素可以阻止胶质瘤电流。同时，这些内向的胶质瘤电流具有强烈的去极化作用，并且能被 GABA 抑制剂阻断，而不被 AMPA 受体抑制剂和 NMDA 受体抑制剂阻断。在一些 DMG 细胞中，还发现了 GABA 能和谷氨酸能神经元可以与同一个 DMG 细胞形成突触。这些结果表明，他们发现的这些结构性 GABA 能神经元 - 胶质瘤突触是具有功能的，就像是发现了一条真正能够 “通车” 的 “秘密通道”。

GABA 使 DMG 细胞去极化

GABA 与受体结合后，会引起带负电的氯离子流动，从而影响细胞膜电位。在成熟的中枢神经系统神经元中，氯离子浓度较低，GABA 激活受体后会导致氯离子内流，使细胞膜超极化。但 OPCs 和一些非神经元细胞中，由于表达高浓度的 NKCC1，氯离子浓度较高，GABA 激活受体后会导致氯离子外流，使细胞膜去极化。研究人员想知道 GABA 对 H3K27M + DMG 细胞的膜电位有什么影响，他们用穿孔膜片记录技术进行研究。结果发现，局部应用 GABA 会在电压钳下诱导 DMG 细胞产生强烈的内向电流，在电流钳下导致相应的去极化，而在 H3/IDH WT 儿童半球性 GBM 移植切片上应用 GABA，几乎不会诱发电流。这表明 DMG 细胞中存在高浓度的细胞内氯离子，通过计算 GABA 电流的反转电位，他们发现 H3K27M + DMG 细胞的细胞内氯离子浓度明显高于 H3/IDH WT 半球性高级别胶质瘤细胞。而且，NKCC1 抑制剂布美他尼可以改变 H3K27M + DMG 细胞的 GABA 电流反转电位，这说明 NKCC1 在维持 DMG 细胞内高氯离子浓度和 GABA 的去极化作用中起着关键作用。

GABA 能神经元促进 DMG 生长

前面发现 GABA 对 DMG 细胞有去极化作用，而过去的研究表明谷氨酸能神经元活动促进胶质瘤进展，并且胶质瘤细胞去极化在神经元活动对胶质瘤增殖的影响中起核心作用。所以研究人员猜测，GABA 能中间神经元是不是也能通过去极化的 GABA 能突触输入来驱动 DMG 增殖呢？他们首先通过全细胞膜片钳电生理学技术，确认可以对 GABA 能神经元 - 胶质瘤突触进行光遗传学靶向。然后，他们在体内实验中，通过病毒载体将 DLX - ChRmine 表达在海马体的中间神经元中，再对这些中间神经元进行光遗传学刺激。结果发现，体内光遗传学刺激 GABA 能中间神经元可以促进移植的 DMG 细胞增殖，还能增加胶质瘤的 Fos 表达。这就像是给 DMG 细胞打了一针 “兴奋剂”，让它们疯狂增殖。此外，他们还发现与 GBM 不同，DMG 受影响的大脑中 GABA 能中间神经元数量相对保持不变，这进一步凸显了 GBM 和 DMG 在 GABA 能生物学上的差异。

苯二氮卓类药物加速 DMG 生长

研究人员还关注到了一种常用药物 —— 苯二氮卓类药物劳拉西泮，它是 GABAA 受体的正向变构调节剂。他们发现，劳拉西泮可以增加 DMG 细胞中 GABA 能突触后电流的幅度，对 H3K27M + DMG 的增殖具有剂量依赖性的促进作用。在对携带患者来源的 DMG 异种移植物的小鼠进行实验时，劳拉西泮处理的小鼠肿瘤总体负担明显增加，生存期缩短。而在 H3/IDH WT 半球性高级别胶质瘤模型中，劳拉西泮对胶质瘤增殖率没有影响。这些结果突出了 GABA 能信号在胶质瘤中的亚型特异性，也给临床用药提了个醒，使用劳拉西泮时需要谨慎考虑其对 DMG 患者的潜在风险。

综合这些研究结果，研究人员发现了 GABA 能神经元和 H3K27M + DMG 细胞之间存在促进生长的突触通讯，揭示了脑癌神经生理学中一种肿瘤亚型特异性机制。这一发现意义重大，就像在黑暗中点亮了一盏明灯。它让我们对 DMG 的发病机制有了更深入的理解，为未来开发针对 DMG 的精准治疗策略提供了重要的理论依据。同时，也提醒了临床医生在使用与 GABA 能信号相关的药物时，要充分考虑不同胶质瘤亚型的差异，避免对患者造成不良影响。相信在这些研究成果的基础上，未来会有更多有效的治疗方法出现，为 DMG 患者带来新的希望。