《Gene Therapy》AAV1.NT3 基因疗法：为多发性硬化症治疗点亮新希望

为解决慢性进展型多发性硬化症（MS）治疗难题，美国全国儿童医院等机构的研究人员开展 AAV1.NT3 基因疗法研究，发现该疗法能减轻 EAE 小鼠疾病严重程度。这为 MS 治疗带来新方向，强烈推荐科研读者阅读。

　　

多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）是一种让人头疼的中枢神经系统疾病，全球有超过 250 万人深受其害。它就像一个隐藏在身体里的 “破坏分子”，不仅引发免疫反应，让中枢神经系统慢性发炎，还会导致神经退化，严重影响患者的生活质量。

MS 患者的中枢神经系统会出现慢性脱髓鞘（髓鞘是包裹在神经纤维外面的一层保护膜，脱髓鞘就是这层膜受到破坏 ）的情况，这会让轴突（神经细胞的一部分，负责传递神经冲动 ）不断受损，而且还很难重新形成髓鞘。目前针对 MS 的治疗已经取得了一些进展，比如在复发阶段的抗炎治疗有了一定成果，但对于慢性进展型 MS，有效的治疗方法还是稀缺资源。随着对疾病的深入了解，人们发现治疗慢性进展型 MS 需要综合运用抗炎、再生和神经保护等多种策略。

在这样的背景下，美国全国儿童医院（The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital）等机构的研究人员决心找到新的治疗方案。他们在《Gene Therapy》期刊上发表了一篇名为 “AAV1.NT3 gene therapy mitigates the severity of autoimmune encephalomyelitis in the mouse model for multiple sclerosis” 的论文。研究发现，AAV1.NT3 基因疗法能够减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，一种模拟 MS 的小鼠模型 ）小鼠的疾病严重程度，为慢性进展型 MS 的治疗带来了新的希望。这一研究成果如果能进一步转化应用，将为众多 MS 患者带来新的曙光，有望改善他们的病情，提高生活质量。

为了开展这项研究，研究人员运用了多个关键技术方法。他们先构建了实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型，通过给小鼠注射特定的物质来诱发疾病。接着利用基因治疗技术，将携带 NT-3 基因的 AAV1 载体注射到小鼠的腓肠肌中。之后，采用多种检测技术，像 ELISA 检测血清中的 NT-3 水平，用 Rotarod 实验和抓力测试评估小鼠的运动功能，借助组织学分析、免疫荧光染色等方法观察小鼠脊髓和大脑的病理变化，还通过 RNA 分离和 mRNA 表达分析炎症相关基因的表达情况。

下面让我们详细看看研究结果：

rAAV.NT-3 载体的制备和效力

研究人员按照之前描述的方法，在实验室成功制备出了自我互补（sc）AAV1.tMCK.NT-3 载体。他们把人 NT-3 的 cDNA 编码序列，放到肌肉特异性 tMCK 启动子的控制下，再包装到 scAAV1 载体中。然后将这种载体注射到诱导出 EAE 的小鼠腓肠肌里。实验结束时采集小鼠的血液样本，用 ELISA 检测发现，接受 AAV1.NT-3 治疗的小鼠血清中能检测到 NT-3，而未治疗组小鼠血清中的 NT-3 水平则低于检测阈值。这表明载体成功发挥作用，让小鼠体内产生了 NT-3。

AAV1.NT-3 基因疗法改善 EAE 小鼠的临床评分和运动功能

研究人员给 8 - 12 周大的 C57BL/6 小鼠注射 MOG35 - 55，成功诱导出 EAE 小鼠模型，这个模型的疾病进程和继发性进展型 MS 很相似。他们用标准的 10 分临床评分系统，每周对小鼠进行三次监测。发现 EAE 诱导后，小鼠在第 2 周疾病活动达到高峰。于是，研究人员在疾病活动高峰 1 周后的平台期，给小鼠注射 AAV1.NT-3 进行治疗。结果显示，接受治疗的小鼠临床评分有了显著改善，而且在抓力测试和 Rotarod 测试中的表现，也比未治疗的小鼠好很多。这说明 AAV1.NT-3 基因疗法能够有效缓解 EAE 小鼠的症状，提高它们的运动能力。

AAV1.NT-3 治疗的 EAE 小鼠脊髓炎症减轻、髓鞘再生和轴突保护得到改善

研究人员对小鼠脊髓进行染色观察。H&E 染色结果显示，未治疗的小鼠脊髓有多处血管周围和软脑膜下炎症，而接受 AAV1.NT-3 治疗的小鼠，炎症明显减少。LFB 染色发现，治疗组小鼠脊髓白质长束得到了更好的保存。免疫荧光定量研究还表明，AAV1.NT-3 基因疗法能显著减少脊髓长束中的轴突损失。而且，治疗后小鼠脊髓中髓鞘碱性蛋白（MBP）和蛋白脂蛋白（PLP）的表达水平增加，这意味着髓鞘再生和轴突保护得到了改善。同时，治疗组小鼠脊髓中的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生也有所减少。这一系列结果都表明，AAV1.NT-3 基因疗法对 EAE 小鼠脊髓有很好的保护和修复作用。

NT-3 在 EAE 小鼠中的免疫调节作用

• 炎症标志物减少：研究人员提取小鼠大脑和脊髓的 RNA，进行实时 PCR 检测炎症标志物的表达。结果发现，在雌性小鼠中，接受 AAV1.NT-3 治疗的小鼠，大脑和脊髓中 TNFα、IL1β 和 IL6 这三种炎症标志物的表达水平都显著降低。在雄性小鼠中，虽然疾病症状相对较轻，但治疗后脊髓中的 TNFα 和 IL6、大脑中的 IL1β 表达水平也明显下降。这说明 AAV1.NT-3 治疗能够有效降低 EAE 小鼠体内的炎症反应。

• Treg 细胞数量增加：调节性 T 细胞（Tregs）在维持外周免疫耐受中起着关键作用。研究人员通过流式细胞术分析发现，接受 AAV1.NT-3 治疗的雌性和雄性小鼠，淋巴结和脾脏中 Tregs 细胞的百分比都显著增加。这表明 AAV1.NT-3 治疗可以增强小鼠的免疫调节能力，抑制自身免疫反应。

• 树突状细胞抑制免疫反应的能力增强：循环中的骨髓来源树突状细胞（DCs）在 EAE 发病过程中很重要。研究人员分离出 DCs，用分枝杆菌刺激后检测 TNFα 的表达。结果发现，未治疗小鼠的 DCs 在刺激后 TNFα 表达显著增加，而接受 AAV1.NT-3 治疗小鼠的 DCs，TNFα 的增加幅度明显较低。这说明 NT-3 能够诱导 DCs 获得抑制免疫反应的能力，进一步证明了 NT-3 的免疫调节作用。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。MS 作为一种复杂的中枢神经系统疾病，目前的治疗手段在应对慢性进展型 MS 时存在诸多不足。而该研究表明，AAV1.NT-3 基因疗法在 EAE 小鼠模型中展现出了良好的治疗效果。它不仅能减轻疾病的临床严重程度，还能在组织学上促进髓鞘再生、保护轴突，同时营造抗炎和免疫调节的环境。这一研究成果为慢性进展型 MS 的治疗提供了新的方向，让人们看到了基因疗法在攻克 MS 这一难题上的潜力。不过，研究人员也指出，虽然目前结果令人鼓舞，但还需要进一步研究，比如评估在 EAE 诱导后疾病活动高峰时给予 AAV1.NT-3 治疗的效果，以及探索 NT-3 调节 Tregs 细胞和 DCs 的具体机制等。相信随着研究的不断深入，AAV1.NT-3 基因疗法有望成为治疗慢性进展型 MS 的有效手段，为广大患者带来新的希望。