颠覆认知！棘阿米巴对成孔毒素的独特抗性及其生态意义大揭秘

为探究 PFTs 与A. castellanii的相互作用，相关研究人员开展了细菌 PFTs 对A. castellanii影响的研究，发现A. castellanii对 PFTs 有独特抗性且二者无直接关联。该研究为理解微生物生态提供新视角，值得科研读者一读。

　　

在微生物的世界里，细菌和宿主细胞之间的 “战争” 一直是科学家们关注的焦点。其中，成孔毒素（Pore-forming toxins，PFTs）作为细菌的 “秘密武器”，在这场 “战争” 中扮演着重要角色。PFTs 是一类广泛存在于不同生物界的蛋白质，由革兰氏阳性和革兰氏阴性致病细菌在感染宿主时产生，是公认的主要毒力因子。它就像细菌发射的 “小导弹”，一旦释放，就能在宿主细胞的膜上打孔，从而帮助细菌在宿主体内扩散或定植。比如，有些 PFTs 能像 “破坏分子” 一样，插入哺乳动物细胞的膜中，引发细胞裂解，对人体健康造成威胁。

然而，在这个微观的 “战场” 上，还有一个神秘的角色 —— 棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）。棘阿米巴是一种在水生和土壤生态系统中常见的变形虫，它有着独特的生活史，能在活跃的滋养体阶段和休眠的包囊阶段之间切换。它不仅是一些人类疾病的病原体，还能捕食多种细菌病原体，和细菌之间有着复杂的相互作用。以前，科学家们大多以哺乳动物细胞为模型来研究 PFTs 的作用，可对于 PFTs 和棘阿米巴之间的互动，了解却非常有限。比如，PFTs-producing 细菌（产生 PFTs 的细菌）遇上棘阿米巴时，是会像攻击哺乳动物细胞一样将其 “打倒”，还是会有不一样的情况发生呢？这就像一个隐藏在黑暗中的谜题，吸引着科学家们去探索。

为了揭开这个谜题，来自相关研究机构的研究人员在《Cell Death & Disease》期刊上发表了一篇名为 “Pore - forming toxins have a minimal role in the interaction of bacteria with Acanthamoeba castellanii” 的论文。通过一系列研究，他们发现棘阿米巴对 PFTs 有着独特的抗性，和哺乳动物细胞的反应大不相同。而且，PFTs-producing 细菌和棘阿米巴的包囊形成之间并没有直接关联。这一发现就像在微生物研究领域投下了一颗 “重磅炸弹”，为我们理解微生物之间的相互作用打开了新的大门，也让我们重新思考棘阿米巴在生态系统中扮演的角色，以及它对细菌的生存和传播可能产生的影响。

研究人员为了完成这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是高通量图像筛选（High-throughput image screening，HTI）技术，它就像一个 “超级显微镜”，能对大量样本进行快速成像和分析，帮助研究人员观察棘阿米巴在不同细菌作用下的各种变化。其次是先进的显微镜技术，比如共聚焦显微镜和全息显微镜，它们可以让研究人员更清晰地看到细胞内部和表面的细微结构和变化，仿佛给研究人员装上了 “透视眼”。此外，蛋白质免疫印迹分析（western blot analysis）能帮助研究人员检测特定蛋白质的表达和变化情况，就像是在细胞的 “蛋白质仓库” 里进行精确盘点。最后，细胞毒性测定（cytotoxicity assays）则可以评估细菌或其产物对细胞的毒性作用，判断细胞是否受到了 “攻击” 以及受损的程度 。

下面我们来详细看看研究人员都发现了什么。

细菌成孔毒素与棘阿米巴包囊诱导之间不存在相关性

为了研究 PFTs 是否会影响棘阿米巴包囊的形成，研究人员开发了一种高通量成像筛选方法。他们就像一群微观世界的 “摄影师”，用吖啶橙和钙荧光白（Calcofluor white，CW）给样本染色，然后使用 Spark Cyto 成像系统给整个 96 孔板拍照，再用 Fiji 插件 “Analyze Particles”、Cellpose 2 和 StarDist 这三款 “图像处理大师” 软件来分析图像。

在比较这三款软件的 “能力” 时，研究人员发现 Cellpose 2 和 StarDist 在划分细胞群方面比 “Analyze Particles” 更厉害。“Analyze Particles” 在处理聚集在一起的滋养体时表现不佳，就像一个不太专业的 “画家”，把原本分开的细胞画到了一起；而 Cellpose 2 能像 “火眼金睛” 一样，准确地把棘阿米巴的滋养体和包囊识别为单个细胞；StarDist 虽然能把包囊当成单个物体识别出来，但在处理形状多变的滋养体时会 “犯迷糊”，经常把一个滋养体错误地分成多个物体。最终，Cellpose 2 凭借出色的表现，成为了研究人员眼中最可靠的 “助手”。

研究人员还发现，不同的细菌对棘阿米巴包囊形成的影响差异很大。像弧菌（Vibrio anguillarum）和真养产碱杆菌（Ralstonia eutropha）能诱导产生大量包囊，是包囊形成的 “强力诱导者”；而一些以产生 PFTs 闻名的环境细菌，如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、霍乱弧菌（V. cholerae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等，诱导产生的包囊却相对较少。这就像是细菌们在 “比赛” 诱导包囊形成，结果各有胜负。而且，同一细菌家族中的不同物种，表现也不一样。比如，霍乱弧菌在诱导包囊形成方面表现平平，而沃氏弧菌（V. wodanis）却表现出色；在芽孢杆菌属中，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）和苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）诱导包囊形成的能力也不如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）。就连能快速裂解哺乳动物细胞的尿路致病性大肠杆菌 536，在诱导棘阿米巴包囊形成方面也没有明显作用。最后，研究人员通过共聚焦显微镜再次确认了这些结果，就像用 “放大镜” 仔细检查一样，最终得出结论：棘阿米巴包囊形成和 PFTs-producing 细菌的存在之间没有显著相关性。

诱导包囊形成的细菌降低了棘阿米巴的运动性

研究人员接着用全息显微镜这个 “神奇工具”，来观察棘阿米巴在遇到不同细菌时的形态变化。当棘阿米巴和大肠杆菌 536 或苏云金芽孢杆菌一起培养时，它的面积和厚度并没有明显变化；但当和弧菌或真养产碱杆菌共培养时，就像被施了 “魔法” 一样，它的总面积明显减小，细胞厚度却增加了。

为了进一步了解棘阿米巴的运动性变化，研究人员进行了无标记相全息成像和单细胞追踪分析。他们发现，感染大肠杆菌 536 或苏云金芽孢杆菌的棘阿米巴，运动性比感染弧菌或真养产碱杆菌的要强。这就好比是棘阿米巴在遇到不同的 “对手” 时，会做出不同的 “运动反应”。那些能诱导包囊形成的细菌，似乎能让棘阿米巴变得 “懒洋洋” 的，运动能力大大下降。所以，研究人员得出结论：诱导包囊形成的细菌会显著降低棘阿米巴的运动性。

棘阿米巴的细胞裂解与细菌产生的 PFTs 无关

研究人员想知道，PFTs-producing 细菌会不会让棘阿米巴发生细胞裂解呢？他们用各种细菌感染棘阿米巴 48 小时，然后用台盼蓝染色和碘化丙啶染色这两种 “检测神器” 来评估细胞膜的完整性。结果发现，弧菌和真养产碱杆菌是让棘阿米巴细胞裂解的 “罪魁祸首”，它们能造成最高程度的细胞裂解。

由于棘阿米巴和哺乳动物巨噬细胞在吞噬行为上有一些相似之处，研究人员决定把研究范围扩大到哺乳动物吞噬细胞。他们用 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞和 THP-1 人类巨噬细胞进行实验，就像在不同的 “战场” 上观察战斗情况。结果发现，大多数 PFTs-producing 细菌能在 37°C 和 25°C 时诱导小鼠 RAW 264.7 巨噬细胞死亡，就像这些细菌在巨噬细胞的 “阵地” 上发起了猛烈攻击；但在相同条件下，棘阿米巴却对 PFTs-producing 细菌的攻击有很强的抵抗力，不会轻易 “阵亡”。为了排除在共培养时细菌不产生 PFTs 的可能性，研究人员还把细菌培养过夜后的无细胞上清液拿出来做实验，结果发现这些上清液能让 THP-1 巨噬细胞死亡，却对棘阿米巴毫无办法。这一系列实验充分证明，和哺乳动物巨噬细胞不同，棘阿米巴能抵抗细菌 PFTs 介导的细胞死亡。

蜡样芽孢杆菌将三聚体毒素成分传递给哺乳动物巨噬细胞和棘阿米巴

研究人员发现蜡样芽孢杆菌能强烈地诱导小鼠和人类巨噬细胞产生细胞毒性反应，就像一颗 “毒炸弹” 在巨噬细胞中爆炸。那么，蜡样芽孢杆菌是如何做到的呢？它会不会把 NheABC 三聚体成孔毒素的成分传递给被感染的巨噬细胞或棘阿米巴呢？

研究人员用蜡样芽孢杆菌 NVH0075/95 菌株进行实验，结果发现野生型蜡样芽孢杆菌能让 RAW 264.7 巨噬细胞的死亡率随着感染复数（MOI）的增加而上升，就像敌人的兵力越多，对巨噬细胞的 “杀伤力” 就越大；而缺少 NheB 和 NheC 成分的 ΔnheBC突变株，对巨噬细胞的细胞毒性却很小。但有趣的是，无论是野生型还是突变株，在相同条件下都无法诱导棘阿米巴死亡。

为了进一步探究 Nhe 三聚体毒素成分的传递情况，研究人员用蛋白质免疫印迹分析这个 “探测器”，来检测被感染的 RAW 264.7 巨噬细胞和棘阿米巴中的 NheB 蛋白。结果证实，NheB 成功地被传递到了这两种细胞中。同时，研究人员还观察到，RAW 264.7 巨噬细胞在感染野生型和突变株蜡样芽孢杆菌后，细胞形态发生了明显变化，就像被 “重塑” 了一样；但棘阿米巴在感染这两种菌株后，细胞形态却没有明显改变。这表明蜡样芽孢杆菌虽然能把毒素成分传递给棘阿米巴，却无法对它造成实质性的伤害。

综合以上研究结果，研究人员得出结论：细菌 PFTs 在与棘阿米巴的相互作用中所起的作用很小。棘阿米巴对通常会裂解哺乳动物细胞的 PFTs 表现出了惊人的抗性，这和它与哺乳动物细胞在脂质组成上的差异可能有关，比如棘阿米巴主要含有麦角固醇和 7 - 脱氢豆甾醇，而哺乳动物细胞主要含有胆固醇，而胆固醇在 PFTs 发挥作用的过程中起着关键作用。而且，棘阿米巴对某些细菌诱导包囊形成的反应存在差异，这说明诱导包囊形成的能力可能并不依赖于 PFTs 的产生，而是和细菌的其他毒力策略或分泌因子有关。

这项研究意义重大。它挑战了我们对细菌 PFTs 在宿主 - 病原体相互作用中作用的传统认知，让我们重新审视 PFTs 在微生物世界中的角色。棘阿米巴对 PFTs 的抗性以及它与细菌之间复杂的相互作用，为我们理解微生物生态学提供了新的视角。它可能在环境中充当某些细菌病原体的 “避风港”，帮助这些病原体在复杂的环境中生存和传播。同时，研究中使用的基于图像的无偏方法和先进的深度学习工具，也为后续研究微生物之间的相互作用提供了新的思路和方法，就像为科学家们打开了一扇通往更深入研究的新大门，让我们对微生物世界的奥秘有了更多探索的可能 。