《Nature Cell Biology》揭秘 MANF：开启肝内胆管癌诊断与干预新大门的 “神秘钥匙”

为解决 ICC 发病机制不明及诊断治疗难题，安徽医科大学第一附属医院的研究人员开展 MANF 在 ICC 中作用的研究。结果发现 MANF 促 ICC 发展且可作生物标志物。该研究为 ICC 诊断和干预提供新方向，值得科研人员一读。

　　

在肝脏的众多疾病中，胆管癌（Cholangiocarcinoma，CCA）是一种极具侵袭性的肝脏恶性胆管上皮肿瘤。它可发生在胆管树的各个区域，其中肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC）因其发病隐匿，多数患者确诊时已处于晚期，手术切除后复发率高，治疗手段有限，严重威胁着人们的健康，成为临床治疗的一大难题。

此前的研究发现，ICC 具有高度的异质性，根据单细胞 RNA 测序数据，可将其分为炎症亚组（S1）、与癌症相关成纤维细胞和细胞外基质蛋白水平最高的亚组（S2）、代谢亚组（S3）以及黏附和胆管特异性蛋白表达最高的亚组（S4）。面对这样复杂的分类，深入研究 ICC 的分子特征和潜在致病因素迫在眉睫。

关于 ICC 的起源，最初人们认为它源自胆管上皮细胞（Biliary Epithelial Cells，BECs）的恶性转化。但近年来的研究打破了这一传统认知，发现肝细胞和肝祖细胞（Hepatic Progenitor Cells，HPCs）在肝脏损伤的刺激下，也可能通过转分化变成 ICC 细胞。众多信号通路，如 Yap、PI3K/AKT、Hedgehog、Notch 等，都参与到肝细胞向 BECs 或 ICC 细胞的转化过程中。然而，成熟肝细胞究竟是如何一步步转化为 BECs、HPCs 或 ICC 细胞的，背后的机制依旧迷雾重重。

在探索 ICC 发病机制的道路上，中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（Mesencephalic Astrocyte-Derived Neurotrophic Factor，MANF）引起了研究人员的注意。MANF 原本是一种内质网应激诱导蛋白，在帕金森病、阿尔茨海默病、脑缺血和糖尿病等疾病中发挥着细胞保护作用。研究人员此前还发现，它在肝脏中也扮演着重要角色，能够保护肝脏免受缺血或药物诱导的损伤，抑制外周炎症。有趣的是，在肝癌中，MANF 却有着截然不同的表现：在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）中它是下调的，能够抑制 HCC 的进展；而在 ICC 中，它却呈现上调状态。那么，MANF 在 ICC 中到底扮演着怎样的角色？它又是如何影响成熟肝细胞的转分化的呢？这些问题吸引着研究人员不断深入探索。

为了解开这些谜团，安徽医科大学第一附属医院的研究人员在《Nature Cell Biology》期刊上发表了题为 “MANF promotes intrahepatic cholangiocarcinoma by driving hepatocyte transformation” 的论文。他们通过一系列实验研究，得出了重要结论：MANF 在 ICC 的发生发展中起着关键的致癌作用，它能够促进成熟肝细胞向 ICC 细胞转化，并且可以作为区分原发性肝癌的生物标志物，为 ICC 的诊断和干预提供了新的方向。这一发现意义重大，为攻克 ICC 这一难题带来了新的希望。

研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键技术方法：首先是构建小鼠模型，利用睡眠美人转座子（Sleeping Beauty Transposon，SBT）系统和硫代乙酰胺（Thioacetamide，TAA）诱导小鼠产生 ICC 模型；其次是细胞实验，使用慢病毒转导技术构建过表达或敲低 MANF 的 ICC 细胞系；然后是利用免疫组化、免疫荧光、蛋白质免疫印迹（Western blot）等实验技术检测相关蛋白和基因的表达水平；此外，还运用了基因编辑技术，通过 CRISPR/Cas9 构建肝细胞特异性 MANF 敲入（KI）和敲除（KO）小鼠；最后借助生物信息分析，从多个数据库获取临床信息和 RNA 测序数据进行分析。

下面来看看具体的研究结果：

• MANF 在人类 ICC 组织中特异性上调且与临床病理特征正相关：研究人员收集了 78 例 ICC 患者的石蜡切片、6 例单纯 ICC 患者的冷冻样本、4 例同时患有 ICC 和 HCC 患者的样本以及 23 例 ICC 患者和 25 例健康个体的血清。通过免疫组化、Western blot、定量 PCR（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测发现，MANF 在 ICC 癌组织中的蛋白、mRNA 水平以及血清中的含量均高于癌旁组织。而且，MANF 高表达与肿瘤直径较大、TNM 分期较晚和远处转移相关，高 MANF 水平还预示着 ICC 患者预后较差。此外，在未分化 ICC（ICC-UDC）中 MANF 表达明显高于分化型 ICC（ICC-DC），而在肝外胆管癌中 MANF 表达无显著变化，这表明 MANF 可作为 ICC 诊断的预测生物标志物。

• MANF 在小鼠 ICC 组织中上调：为进一步研究 MANF 在 ICC 组织中的情况，研究人员利用 SBT 系统构建小鼠 ICC 模型。他们发现，SBT 诱导的 ICC 小鼠体重在后期下降，肝体比增加，血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）水平升高，肝脏出现明显的囊性腺样变化，且 MANF 在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，其 mRNA 和蛋白水平也明显增加。之后，研究人员又使用 TAA 诱导的 ICC 模型进行验证，得到了类似的结果，再次证实了 MANF 在小鼠 ICC 组织中上调。

• MANF 促进 ICC 细胞系的恶性生物学行为：为探究 MANF 在 ICC 中的致癌作用，研究人员检测了 Hucct1、HCCC9810 和 RBE 细胞系中 MANF 的水平，发现 Hucct1 细胞中 MANF 表达最高。随后，他们制备了含 MANF DNA 的慢病毒转导颗粒（MANF OE）和短发夹 RNA（shMANF），并分别转染到 ICC 细胞系中。结果显示，MANF OE 细胞的增殖和侵袭能力比对照组更强，而 shMANF 则起到相反的作用。此外，MANF OE 增加了间质标记蛋白 β - 连环蛋白和波形蛋白的水平，降低了上皮标记蛋白 Occludin、Claudin 和 E - 钙粘蛋白的水平，shMANF 的作用则与之相反。在体内实验中，将稳定敲低 MANF 的 Hucct1 细胞皮下注射到裸鼠体内，发现肿瘤的大小、体积和重量均减小，这表明高表达的 MANF 在体外和体内都能促进 ICC 细胞的恶性生物学行为。

• 肝细胞特异性 MANF 敲入加速 SBT 诱导的 ICC：研究人员通过 CRISPER - Cas9 技术构建了成熟肝细胞特异性 MANF 敲入（KI）小鼠，然后用 SBT 诱导其产生 ICC 模型。结果发现，MANF KI 小鼠的肝脏大小、肿瘤数量、肿瘤面积和肝体比均显著增加，血清中 ALT、AST、TBIL 和 DBIL 水平也明显上升，MANF、CK19 和 Ki67 的 mRNA 和蛋白水平也升高，这说明肝细胞特异性 MANF KI 促进了小鼠 ICC 的发生和发展。

• 肝细胞特异性 MANF 敲除抑制 SBT 诱导的 ICC：研究人员以同样的方法构建了成熟肝细胞特异性 MANF 敲除（KO）小鼠。实验结果显示，MANF KO 小鼠在 SBT 诱导下，肝脏大小、肿瘤数量和面积更小，肝体比更低，血清中 ALT、AST、TBIL 和 DBIL 水平更差，MANF、CK19 和 Ki67 的 mRNA 和蛋白水平也降低，这表明成熟肝细胞特异性 MANF KO 抑制了 SBT 诱导的小鼠 ICC。

• 肝脏 MANF 敲除减缓 TAA 诱导的 ICC，rhMANF 补充可挽救这一变化：考虑到 ICC 分子表型的多样性，研究人员构建了肝脏 MANF 敲除（HKO）小鼠，并给予重组人 MANF（rhMANF）进行干预。结果发现，HKO 小鼠在 TAA 诱导下，肿瘤大小和数量、肝体比、血清 ALT 和 AST 水平以及肿瘤面积均显著降低，而 rhMANF 的补充则抑制了这种降低，且 rhMANF 处理后 CK19 的 mRNA 和蛋白水平增加，这进一步证明肝脏 MANF KO 抑制 ICC，而 rhMANF 补充促进 ICC 并抵消了 MANF KO 对 ICC 的抑制作用。

• 特定谱系追踪揭示 ICC 中肝细胞的重编程：为探究 MANF 影响 ICC 的潜在机制，研究人员利用 tdTomato 荧光报告小鼠进行成熟肝细胞谱系追踪。他们发现，在 SBT 诱导的 ICC 小鼠中，tdTomato 和 CK19 共定位，且在 TAA 诱导的 ICC 小鼠中发现了 HNF4α?CK19?细胞，这表明肝细胞在 SBT 或 TAA 刺激下可重编程为 ICC 细胞。此外，研究还发现成熟肝细胞可转化为 CD133?干细胞和 α - SMA?肌成纤维细胞，但不转化为 F4/80?巨噬细胞。

• MANF 促进肝细胞向 ICC 细胞的转化：研究人员构建了成熟肝细胞特异性 MANF KI/KO 谱系追踪小鼠，并用 SBT 诱导其产生 ICC 模型。结果显示，tdTomato MANF KI 小鼠肝脏组织中 tdTomato?CK19?细胞比对照组更多，而 tdTomato MANF KO 小鼠中则减少。在 TAA 诱导的 ICC 小鼠中也观察到类似现象，且 rhMANF 处理后 CK19 水平增加。在体外实验中，用 rhMANF 处理从 tdTomato 小鼠分离的原代肝细胞，可观察到明显的导管形成，tdTomato?CK19?细胞数量和细胞质 CK19 水平增加，HNF4α 水平下降，这表明 MANF 驱动成熟肝细胞向 ICC 细胞转化。

• MANF 通过与 CK19 的 Ser35 位点结合将其滞留在细胞质中：研究人员观察到在 TAA 诱导的 ICC 小鼠中，rhMANF 处理后 CK19 主要定位于细胞质。通过实验发现，MANF 与 CK19 相互作用，且这种相互作用主要发生在细胞质中。突变 CK19 的 Ser35 位点为 Ala35（CK19S35A）可取消 MANF 与 CK19 的相互作用，过表达 HA - CK19S35A 会使 CK19 在细胞膜上的水平降低，在细胞质中的水平增加，这表明 MANF 通过与 CK19 的 Ser35 位点结合抑制其膜转位。

• CK19 稳定 NICD2 蛋白水平以增强其核信号传导：研究人员通过免疫共沉淀（Co - IP）结合质谱（MS）筛选出与 CK19 相互作用的蛋白，发现 Notch2 是候选蛋白之一。进一步实验验证了 CK19 与 Notch2 的相互作用，且 CK19 与 Notch2 细胞内结构域（NICD2）的 AR 结构域相互作用。在原代肝细胞中，MANF 敲除降低了细胞质 CK19 和 NICD2 的水平，而 MANF 过表达则增加了它们的水平。CHX chase 实验表明 CK19 过表达可增加 Notch2 的稳定性和半衰期。此外，研究还发现 MANF、CK19 和 Notch2 在 ICC 中存在共定位，且 MANF 可能作为桥梁连接 CK19 和 NICD2，这说明 CK19 稳定 NICD2 蛋白水平，进而增强其核信号传导。

• MANF 依赖 CK19 和 Notch2 促进肝细胞来源的 ICC：为探究 NICD2 在 MANF 调节肝细胞向 ICC 细胞转分化中的作用，研究人员在 tdTomato MANF KI 小鼠中使用 AAV8 - TBG - shVector/Notch2 下调 Notch2。结果发现，Notch2 沉默后，肝脏明显变小，肿瘤数量和面积、肝重比均显著降低，MANF 过表达诱导的 CK19、Ki67、CK7 上调和 HNF4α 下调可被 Notch2 敲低逆转，且 tdTomato?CK19?细胞的增加也可被部分挽救。同时，沉默 CK19 也可部分抑制 MANF 过表达诱导的 Notch2 和 CK7 上调，沉默 MANF 会减少 CK19 与 NICD2 的相互作用，这表明 MANF 促进肝细胞向 ICC 细胞重编程的作用部分依赖于 CK19 和 Notch2。

综合上述研究结果，研究人员发现 MANF 在 ICC 组织中高表达，且与患者的生存情况相关。MANF 在 ICC 中扮演着致癌角色，它通过与 CK19 的 Ser35 位点结合，抑制 CK19 的膜转位，使 CK19 滞留在细胞质中。细胞质中的 CK19 与 NICD2 的 AR 结构域相互作用，稳定 NICD2 的蛋白水平，激活其核信号传导，从而加速成熟肝细胞向 ICC 细胞的转化。

这项研究意义非凡。一方面，MANF 可作为区分 ICC 和 HCC 的新型生物标志物，还能用于预测 ICC 的肿瘤分期。由于 MANF 是一种分泌蛋白，可在血清中轻易检测到，这为 ICC 的早期无创诊断提供了新的可能。另一方面，MANF 在 ICC 中的致癌作用使其成为潜在的治疗靶点，针对 MANF 的小分子抑制剂的研发，有望为 ICC 的治疗开辟新的道路。 此外，该研究还揭示了 MANF 在肝细胞向不同类型肝癌细胞转化过程中的重要作用，为理解肝癌的发生发展机制提供了新的视角。不过，研究也存在一些局限性，如构建小鼠模型时使用的工具小鼠各有局限，未来还需要进一步深入研究，以更全面地揭示 ICC 的发病机制，为临床治疗提供更有效的策略。