编辑推荐：
为解决肺癌免疫治疗耐药及副作用问题，南京大学医学院附属鼓楼医院研究人员开展 GPNPs 治疗肺癌研究。结果显示 GPNPs 能抑制肿瘤进展且无明显副作用。该研究为肺癌免疫治疗提供新方向，推荐科研读者阅读。
肺癌，这个 “健康杀手”，一直是癌症相关死亡的重要原因之一。随着医学的不断进步，免疫疗法，尤其是免疫检查点抑制剂（ICIs），如程序性细胞死亡蛋白 1（PD - 1）/ 程序性死亡配体 1（PD - L1）抑制剂的出现，给肺癌治疗带来了新的希望，它们能够逆转肿瘤细胞的免疫逃逸，激发机体的抗肿瘤反应。
然而，免疫治疗并非一帆风顺。单药治疗的耐药问题成为了一道难以跨越的障碍，只有部分患者能从中受益。就好像给患者们打开了一扇希望之门，却又在门前设置了重重关卡。而转化生长因子 - β（TGF - β），这个在免疫平衡中发挥重要作用的因子，在肿瘤的发展过程中却 “倒戈相向”，不仅帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸，还助力其转移。
研究发现，同时靶向 PD - 1/PD - L1 和 TGF - β 通路，或许能增强抗肿瘤效果。可这一联合策略在实际应用中困难重重，药物渗透受限，还会带来严重的全身副作用，就像带着沉重的枷锁前行，每一步都异常艰难。
为了突破这些困境，南京大学医学院附属鼓楼医院的研究人员们开启了一场科研攻坚之旅。他们的研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》期刊上，论文题目是 “Enzymatically responsive nanocarriers targeting PD - 1 and TGF - β pathways reverse immunotherapeutic resistance and elicit robust therapeutic efficacy”。研究人员成功开发出了明胶酶响应性纳米颗粒（GPNPs），这种纳米颗粒可以同时递送抗 PD - 1 抗体（αPD - 1）和 TGF - β 受体 I 抑制剂 Galunisertib（Gal）。他们发现，GPNPs 能够有效抑制肿瘤进展，而且没有明显的副作用。这一成果为肺癌免疫治疗带来了新的曙光，有望改写肺癌治疗的格局。
在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。他们通过双乳液法制备并表征 GPNPs，利用透射电子显微镜（TEM）观察其形态，动态光散射（DLS）测量其大小和电位 ；借助流式细胞术和细胞计数法评估其细胞毒性；运用动物实验，包括建立小鼠肿瘤模型，观察肿瘤生长、生存时间等指标；还采用 RNA 测序、单细胞 RNA 测序（scRNAseq）分析肿瘤微环境中的基因表达变化 ；通过命运映射模型追踪成纤维细胞的变化，探究肿瘤治疗的机制。
下面，让我们一起来看看具体的研究结果。
1. GPNPs 的制备与表征
研究人员通过酰胺化反应合成了甲氧基聚乙二醇 - 聚己内酯（mPEG - PVGLIG - PCL），并采用双乳液法将 αPD - 1 和 Gal 负载到 mPEG - PVGLIG - PCL 上，成功制备出 GPNPs。TEM 图像显示，GPNPs 呈现出圆滚滚的球形形态。DLS 测量结果表明，它具有中性表面电荷，水动力直径约为 224.67 ± 2.40nm，多分散指数较低，说明颗粒大小较为均一。αPD - 1 和 Gal 的负载量分别为 11.37 ± 0.30% 和 4.32 ± 0.11%，封装效率也较为可观。在体外药物释放实验中，50 小时内超过 40% 的 αPD - 1 和 15% 的 Gal 从 GPNPs 中释放出来。而且，GPNPs 在稳定性测试中表现出色，随着时间推移，其大小和电位都没有明显变化。细胞活力和干扰素 - γ（IFNγ）分泌实验显示，不同配方的 GPNPs 几乎没有细胞毒性，还能增强免疫功能。此外，携带近红外染料 DiR 的纳米颗粒在 40 小时内聚集在肿瘤部位，证实了 GPNPs 的靶向能力，就像给药物装上了精准导航，能准确地找到肿瘤这个 “敌人”。
2. GPNPs 的抗肿瘤疗效和毒性评估
研究人员在皮下接种 Lewis 肺癌（LLC）细胞的小鼠模型中评估 GPNPs 的抗肿瘤疗效。当肿瘤体积达到约 100mm3 时，开始对小鼠进行分组治疗，分别给予生理盐水、αPD - 1、αPD - 1/Gal 和 GPNPs。结果令人惊喜，GPNPs 显著抑制了肿瘤生长，接受 GPNPs 治疗的小鼠中，60% 在治疗开始 18 天后仍然存活，而 αPD - 1/Gal 治疗组的生存获益则相对较小。在携带 A549 细胞的 BALB/c 裸鼠模型中，联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）治疗，GPNP 治疗组同样表现出肿瘤生长延迟和生存期延长的效果。此外，通过再接种实验发现，之前接受 GPNPs 治疗的小鼠，肿瘤发生率降低，生长速度也明显减慢，这表明 GPNPs 不仅能有效抑制当下的肿瘤，还能促进长期免疫记忆的形成。在治疗过程中，研究人员密切监测小鼠体重，发现各组小鼠体重没有明显变化。治疗结束后，对主要器官进行组织学检查和血清生物标志物检测，结果显示 GPNPs 对心脏、肝脏和肾脏功能没有明显影响，而 αPD - 1 组的心脏生物标志物略有升高，提示可能存在心脏疾病风险，这也凸显了 GPNPs 在安全性方面的优势。
3. 肿瘤微环境（TME）中的免疫特征
虽然 GPNPs 在体内展现出显著的抗肿瘤效果，但肿瘤微环境的复杂性使得其中的免疫机制尚不明确。研究人员利用流式细胞术对肿瘤微环境的免疫表型进行分析，发现 GPNPs 和 αPD - 1/Gal 治疗都促进了 CD8? T 细胞的浸润，而且 GPNPs 治疗组中早期激活的 CD38?CD8?和 CD69?CD8? T 细胞比例更高。有趣的是，GPNPs 治疗还增加了功能失调的 PD - 1?CD8? T 细胞比例。除了 CD8? T 细胞，GPNPs 治疗也促进了 CD4? T 细胞的浸润，不过这也导致了具有免疫抑制作用的调节性 T 细胞（Treg）和 PD - 1? Treg 细胞比例增加，但同时激活的 CD69? Treg 细胞也有所增加。在单核细胞 / 巨噬细胞（Mo/Mf）群体方面，GPNPs 治疗降低了 M2 型巨噬细胞的比例，使得 M1/M2 比值更有利于抗肿瘤免疫。通过细胞时间飞行质谱（cyTOF）同时筛选 41 种免疫相关标志物，研究人员发现 GPNP 治疗组在肿瘤内具有独特的 T 细胞表型，CD8? T 细胞比例最高，CD4?调节性 T 细胞比例最低。而且，在 GPNP 治疗组中，PD - L1?CD38?CD206? M2 巨噬细胞和 PD - 1?CD38?MHCII?低 CD206? M2 巨噬细胞几乎消失。RNA 测序分析进一步揭示了 GPNP 治疗组和 αPD - 1/Gal 治疗组之间的转录组差异，发现了一些与免疫反应和巨噬细胞重编程相关的差异表达基因，这些基因在调节肿瘤微环境中的免疫细胞招募和功能方面发挥着重要作用。
4. TME 中的细胞外基质（ECM）修饰
研究人员通过批量 RNA 测序分析发现，GPNP 治疗对 ECM 重塑有显著影响。与对照组相比，GPNP 治疗组中与胶原蛋白沉积相关的基因，如 Col1a1、Col1a2、Col12a1、Col3a1 和 Col5a2 等显著上调，同时 TGF - β 信号通路和心肌病相关基因的表达也存在差异。基因本体（GO）富集分析表明，这些差异表达基因与趋化作用、免疫反应、细胞黏附、细胞生长的负调控、细胞外基质组织等多个生物学过程相关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，它们涉及趋化因子信号通路、蛋白质消化和吸收、细胞因子 - 细胞因子受体相互作用等途径。为了更深入了解 ECM 在肿瘤微环境中的变化，研究人员进行了单细胞 RNA 测序（scRNAseq）。他们从 GPNP 治疗的肿瘤中获得了 10726 个细胞的单细胞转录组，鉴定出 16 个主要细胞簇，可分为 5 种主要细胞类型，包括癌症相关成纤维细胞（CAF）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、T 细胞、内皮细胞和粒细胞。其中，cluster 14 高度表达胶原蛋白基因家族和其他 ECM 修饰基因，被指定为基质重塑 CAF。对 cluster 14 进行 GO 富集分析发现，上调基因在 ECM 重塑、免疫串扰、细胞行为、代谢效应、体内平衡和信号串扰等多个方面都有富集。KEGG 和 Reactome 富集分析也显示了与 ECM - 受体相互作用、PDGF 信号通路等的相关性，这进一步揭示了 GPNP 治疗对 ECM 重塑的复杂调控机制。
5. 成纤维细胞在胶原蛋白沉积中的作用和成纤维细胞命运映射
为了验证转录组分析中 ECM 的变化，研究人员进行了 Masson 三色染色，结果发现对照组肿瘤组织中胶原蛋白沉积水平较高，尤其是在血管周围区域，而 αPD - 1/Gal 和 GPNPs 组几乎没有染色，这证实了 RNA 测序中 ECM 重塑的转录组改变。成纤维细胞是细胞外基质的主要成分，在激活后会大量产生胶原蛋白。研究人员通过免疫组织化学观察到，对照组中 α 平滑肌肌动蛋白（αSMA，一种肌成纤维细胞特异性标志物）的表达远远高于 GPNP 组。为了探究成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的机制，研究人员建立了 Pdgfrα - Cre; Rosa26 - CAG - LSL - tdTomato（Pdgfrα - Cre/TdT）转基因小鼠模型进行命运映射分析。在肿瘤形成第 14 天，他们发现生理盐水（NS）和 αPD - 1 组中 Pdgfrα 和 αSMA 存在共定位，证实了肿瘤微环境中存在成纤维细胞激活和向肌成纤维细胞转化的活动；而 αPD - 1/Gal 和 GPNP 治疗组中则没有观察到这种共定位，表明这两种治疗方法都能稳定成纤维细胞，但差异可能仅在转录组水平才能体现出来。此外，研究人员还发现 αPD - 1/Gal 组中 Pdgfrα 与波形蛋白（vimentin）共定位，而 GPNP 组没有；αPD - 1 组中 Pdgfrα 分别与层粘连蛋白（laminin）和纤连蛋白（fibronectin）共定位，这些结果暗示了不同治疗方法对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。
研究人员开发的 GPNPs 为肺癌免疫治疗带来了新的希望。这种纳米载体能够有效靶向肿瘤，在不产生明显全身副作用的情况下，显著抑制肿瘤生长，激发机体的抗肿瘤免疫反应，还能促进长期免疫记忆的形成。通过对肿瘤微环境中免疫特征和 ECM 修饰的深入研究，揭示了 GPNPs 治疗肺癌的潜在机制，为临床转化提供了重要的理论依据。不过，研究也存在一些局限性，比如样本量较小、临床前模型不能完全反映临床实际情况、免疫和转录组分析可能不全面等。但这并不影响这项研究的重要意义，它为肺癌免疫治疗指明了新的方向，未来有望通过进一步研究克服这些局限性，让 GPNPs 真正成为肺癌患者的 “救星”，为攻克肺癌这一难题贡献关键力量。
