单侧咬合缺失竟让大鼠颞下颌关节 “变形”？Notch1/Hes1 信号通路来 “揭秘”！

为探究不平衡咬合负荷对 TMJ 及 Notch1/Hes1 信号通路表达的影响，吉林大学研究人员开展相关研究。结果发现生长大鼠 TMJ 在咬合变化时有重塑能力。该研究为治疗 TMJ 退行性疾病提供新方向，值得科研读者一读。

　　

在人体的口腔颌面部，有一个极为重要却常常被忽视的 “小关节”—— 颞下颌关节（Temporomandibular Joint，TMJ）。它就像一个精密的 “小零件”，连接着我们的下颌骨和颅骨，负责着嘴巴的张合、咀嚼等重要功能 。而咬合（简单理解为上下牙齿的接触和配合）与这个关节的关系那可是相当紧密，就像钥匙和锁，合适的咬合能让颞下颌关节正常运转，要是咬合出了问题，颞下颌关节也会跟着 “闹脾气”。

目前，关于咬合和颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular Joint Disorder，TMD）之间的关系，学术界就像炸开了锅，争论不休。有些学者认为，像单侧咀嚼这种导致咬合力量分布不均匀的情况，是引发颞下颌关节紊乱病的 “罪魁祸首” 之一 。可也有不少学者持反对意见，他们通过研究发现，并没有足够的证据能证明咬合在颞下颌关节紊乱病的发病过程中起着关键作用 。由于涉及人体伦理问题，想要彻底搞清楚咬合在颞下颌关节紊乱病病因中扮演的角色，简直比登天还难。

不仅如此，异常的咬合负荷对颞下颌关节生长发育的影响也十分复杂。之前的研究虽然尝试用各种方法去探究，比如拔掉实验动物的磨牙或者修剪它们的门牙，但这些方法都没能精准模拟出单侧咀嚼时双侧颞下颌关节承受不平衡咬合负荷的真实场景。而且，实验结果也是五花八门，让人一头雾水，这使得我们对功能性负荷改变和颞下颌关节生长之间的关系更加摸不着头脑。

另外，在颞下颌关节的生长发育过程中，有一条神秘的信号通路 ——Notch1/Hes1 信号通路。它在关节软骨的细胞增殖、分化等过程中发挥着重要作用。可是，当生长过程中出现不对称的咬合负荷时，这条信号通路在颞下颌关节髁突软骨中的表现如何，几乎没人研究过。还有关节盘，它是颞下颌关节里主要的应力分布组织，就像一个 “缓冲垫”，能减少关节运动时产生的各种力。但异常咬合负荷会对关节盘造成什么影响，同样有待探索。

在这样的背景下，吉林大学口腔医院口腔颌面外科及口腔整形美容外科的研究人员 Miao Xiao、Qi Yue、Zhenyao Qin 等人决心揭开这些谜团。他们在《BMC Oral Health》期刊上发表了一篇名为 “Unbalanced occlusal loading elicited remodeling responses in growing rat temporomandibular joints and Notch1/Hes1 signaling pathway expression” 的论文。经过一系列严谨的研究，他们发现生长中的大鼠颞下颌关节髁突在咬合负荷改变时，有着很强的重塑能力，不过这种重塑可能是退化性的，也可能是恢复性的，这取决于咬合负荷是减少还是恢复。而且，合适的咬合负荷对于颞下颌关节盘的正常代谢以及 Notch1/Hes1 信号通路的传导至关重要。这一研究成果，就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为治疗颞下颌关节相关的退行性疾病提供了全新的研究方向。

为了完成这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是建立动物模型，他们通过拔除 3 周龄雌性 Wistar 大鼠左侧下颌磨牙，并每隔一天修剪左侧下颌门牙的方式，构建了单侧咬合缺失的动物模型，同时设置了恢复切牙咬合实验组和正常负荷对照组；其次，利用 Micro-CT 对样本进行扫描，通过分析扫描图像，了解髁突软骨下骨的结构变化；然后，运用组织学染色（如 HE 染色、甲苯胺蓝（Toluidine Blue，TB）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphate，TRAP）染色）、免疫荧光染色、免疫组化染色以及实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）等技术，来观察和检测髁突软骨、关节盘以及相关信号通路分子的变化情况。

下面，让我们一起来看看他们都有哪些重要的研究结果吧。

软骨厚度测量及组织形态学变化

研究人员发现，根据髁突软骨细胞的排列、大小、形态以及基质钙化程度的不同，可以将髁突软骨从表面到深层依次分为四层：纤维层、增殖层、成熟层和肥大层。在正常负荷的对照组中，髁突软骨表面光滑连续，各层界限清晰，细胞排列得整整齐齐。但在单侧咬合缺失实验组（ULE 组）中，情况就大不一样了。在实验进行到 4 周和 6 周时，ULE 组拔牙侧的髁突软骨厚度明显比对照组薄，纤维层也变得更薄，而且软骨的分层逐渐模糊，细胞排列杂乱无章，成熟区的软骨细胞数量大幅减少，这些都是软骨开始退化的迹象。随着咬合负荷减少的时间越来越长，到了 10 周，ULE 组拔牙侧髁突软骨的所有层次都变得杂乱无章，肥大层出现不连续，肥大软骨细胞也所剩无几，软骨层和纤维层的厚度进一步减小。不过，在恢复切牙咬合实验组（RLE 组）中，当恢复咬合负荷 2 周后，情况出现了转机。软骨层的排列重新变得有序，软骨细胞数量明显增加，拔牙侧髁突软骨和纤维层的厚度比同年龄段的 ULE 组更厚，这表明部分咬合负荷的恢复能够促进软骨的修复性重塑，增加软骨厚度。只是到了 10 周，RLE 组和 ULE 组拔牙侧的软骨厚度差异不再具有统计学意义，这可能是因为随着髁突软骨的老化，软骨细胞的增殖能力下降了。

Cyclin D1 在软骨细胞中的表达

Cyclin D1 阳性的软骨细胞主要分布在增殖层，它的表达情况能反映软骨细胞的增殖活性。在 ULE 组中，拔牙侧的 Cyclin D1 阳性软骨细胞数量在 4 周、6 周和 10 周时都明显减少，而且在 6 周和 10 周时减少得更加明显，这说明缺乏咬合负荷会削弱软骨细胞的增殖能力。而在 RLE 组中，6 周时拔牙侧的 Cyclin D1 阳性软骨细胞数量相比同年龄段的 ULE 组显著增加，不过到了 10 周，两组之间就没有明显差异了。在非拔牙侧，ULE 组和 RLE 组在各个时间点的 Cyclin D1 阳性软骨细胞数量与对照组相比，都没有统计学意义上的差异。

髁突软骨细胞外基质的表达

研究人员用 TB 染色和 II 型胶原（Col II）免疫组化染色来观察软骨细胞外基质中蛋白多糖和 Col II 的表达变化。结果发现，在实验 4 周时，ULE 组非拔牙侧的 Col II 和 TB 染色阳性区域比对照组大，颜色也更深；但到了 6 周和 10 周，ULE 组拔牙侧的 TB 染色和 Col II 免疫组化染色阳性区域分布不均匀，颜色变浅，而且面积比对照组小。到了 10 周，ULE 组拔牙侧软骨局部肥大层不连续的区域甚至没有 TB 染色阳性表达。而 RLE 组在 6 周时，拔牙侧的 Col II 和 TB 染色阳性区域相比同年龄段的 ULE 组有所增加，不过到 10 周时，这种差异就不明显了。

免疫荧光染色检测软骨中 Notch1、Jagged1 和 Hes1 的表达

研究人员对软骨层中 Notch1、Jagged1 和 Hes1 阳性细胞的数量进行了测量。在 ULE 组中，拔牙侧的 Notch1、Jagged1 和 Hes1 阳性软骨细胞在 4 周和 6 周时比对照组明显减少；到了 10 周，Notch1 阳性软骨细胞仍然显著减少，但 Jagged1 和 Hes1 阳性软骨细胞与对照组相比没有明显差异。在 RLE 组中，恢复切牙功能负荷 2 周后，拔牙侧的 Notch1、Jagged1 和 Hes1 阳性软骨细胞数量相比同年龄段的 ULE 组明显增加；但到 10 周时，两组之间又没有差异了。在 ULE 组的非拔牙侧，4 周时 Notch1、Jagged1 和 Hes1 阳性软骨细胞数量比对照组减少，不过恢复切牙功能负荷后，这些细胞数量在 6 周时反而比对照组增加了。

软骨中的基因表达水平

研究人员还检测了软骨中相关基因的表达水平。结果显示，ULE 组拔牙侧在所有时间点，由于缺乏咬合功能负荷，Cyclin D1 的 mRNA 表达水平都比对照组显著降低；而在非拔牙侧，它与对照组没有明显差异。在 RLE 组中，6 周和 10 周时拔牙侧的 Cyclin D1 mRNA 水平比 ULE 组拔牙侧更高。在 ULE 组拔牙侧，Notch1、Jagged1 和 Hes1 的 mRNA 表达在 4 周和 6 周时下降；在非拔牙侧，6 周时这些基因的 mRNA 表达水平比对照组高。在 RLE 组中，恢复功能负荷 2 周后，拔牙侧的 Notch1、Hes1 和 Jagged1 mRNA 表达相比 ULE 组拔牙侧有所增加。此外，研究人员还检测了与成骨和破骨能力相关的基因，发现 ULE 组拔牙侧的 Runx2 mRNA 表达在 4 周和 6 周时比对照组增加，ALP 在 10 周时增加；RLE 组在 6 周时，拔牙侧的 ALP mRNA 表达比 ULE 组拔牙侧更高。RANKL 的表达在 ULE 组拔牙侧和非拔牙侧只有在 4 周时比对照组增加，在 RLE 组拔牙侧 6 周时比 ULE 组拔牙侧增加，但 10 周时又下降了。

软骨下骨的变化

在 4 周时，ULE 组拔牙侧和非拔牙侧的软骨下骨都出现了骨量减少、骨小梁变窄、小梁间距增宽的情况。不过从 4 周到 6 周，ULE 组的软骨下骨小梁逐渐增宽，小梁间距变窄；到了 10 周，ULE 组拔牙侧的髁突软骨下骨髓腔变得非常狭窄，骨小梁明显增宽，骨体积分数（BV/TV）比对照组更高。在 RLE 组中，6 周时拔牙侧的 BV/TV 和骨小梁厚度（Tb.Th）比同年龄段的 ULE 组低，但与对照组相比没有统计学差异；10 周时，RLE 组拔牙侧的软骨下骨各项测量指标与对照组相比也没有明显差异。

软骨下骨中破骨细胞活性的变化

4 周时，ULE 组拔牙侧和非拔牙侧的 TRAP 阳性细胞数量（代表破骨细胞数量）比对照组增加；6 周时，ULE 组拔牙侧和非拔牙侧的 TRAP 阳性细胞数量与对照组没有差异；到 10 周时，这些细胞数量又减少了。在 RLE 组中，恢复切牙咬合负荷 2 周后，拔牙侧的 TRAP 阳性细胞数量相比同年龄段的 ULE 组有所增加。

关节盘厚度及相关分子 mRNA 表达水平

在实验的三个时间点，实验组和对照组的关节盘前、中、后区厚度都没有明显差异。但在分子水平上，从 4 周到 6 周，ULE 组和 RLE 组关节盘中的 Col I、Col II 和 ALP 的 mRNA 表达水平相比对照组都有所下降。ULE 组中，Col I 的 mRNA 表达在 4 周和 10 周时下降，Col II 和 ALP 的 mRNA 表达从 4 周到 10 周持续下降。

从这些研究结果可以看出，单侧咬合缺失会导致大鼠颞下颌关节髁突出现退化性改变，主要表现在拔牙侧，包括软骨变薄、软骨细胞增殖活性降低、基质降解、软骨下骨暂时骨量减少以及颞下颌关节盘分子的 mRNA 表达水平下降等。而部分咬合负荷的恢复能够在一定程度上缓解颞下颌关节的退化。这表明合适的咬合负荷对于颞下颌关节的生长发育以及维持其正常功能至关重要。当咬合负荷减少时，会出现类似骨关节炎的特征，如软骨降解、细胞外基质减少和软骨下骨吸收等，这也暗示着单侧咬合缺陷可能与骨关节炎有关，本次研究使用的动物模型或许可以作为骨关节炎的研究模型。此外，研究还发现 Notch1/Hes1 信号通路与颞下颌关节软骨的变化密切相关，减少的咀嚼负荷会阻碍该信号通路，进而影响软骨的发育。

这项研究意义重大，它不仅为我们深入了解咬合负荷与颞下颌关节生长发育之间的关系提供了重要依据，还为治疗颞下颌关节相关的退行性疾病指明了新的方向。未来，研究人员可以进一步探究咬合负荷改变影响颞下颌关节髁突的具体机制，以及这种适应性重塑随时间的变化规律，从而为患者提供更有效的治疗方法，帮助那些被颞下颌关节疾病困扰的人们摆脱痛苦，恢复正常的生活。