《Cell & Bioscience》癌细胞外囊泡中的 lncRNA MIR181A1HG 如何 “助力” 结直肠癌肝转移？

为探究结直肠癌肝转移（CRLM）机制，复旦大学附属中山医院等单位研究人员开展关于 lncRNA MIR181A1HG 在其中作用的研究。发现其可促进 CRLM，这为 CRLM 机制研究和治疗提供新方向，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是一个 “狠角色”，它在每年新诊断出的癌症病例和癌症相关死亡病例中，都占据着约 10% 的比例。尽管医学在不断进步，治疗手段越来越多，但 CRC 患者的死亡率，尤其是发生转移的患者，依旧居高不下。其中，肝脏是 CRC 最常转移的 “目的地”，大约 50% 的结直肠癌肝转移（Colorectal Liver Metastasis，CRLM）患者，会出现同时性或异时性的肝转移 。

肝转移的发生可不是个简单的过程，它依赖于 “前转移龛”（Premetastatic Niches，PMNs）的形成，这就像是肿瘤细胞为自己在肝脏里搭建的 “小窝”，让它们能更好地在肝脏 “扎根”、生长。PMN 的形成需要肿瘤细胞和肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）中的基质细胞 “密切交流”，而肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells，HSCs）作为肝脏里的 “原住民”，在这个过程中起着关键作用。当肿瘤细胞入侵肝脏时，HSCs 就会被激活，变成肿瘤相关的肌成纤维细胞，它们通过改变细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的质量和数量，打造出富含 I 型胶原蛋白的 “疤痕” 基质，为肿瘤细胞的转移 “铺路” 。

另外，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）也在 TME 中被发现了。这些小小的膜泡里装着蛋白质、脂质、RNA 和 DNA 等各种 “宝贝”，它们能在细胞之间 “运送物资”，在癌症发展，尤其是 PMN 形成和转移过程中，发挥着重要作用。之前有研究表明，高转移性结直肠癌细胞和 HSCs 之间存在显著的相互作用，会影响 CRLM 的发生，而且这个过程还和 CRC 细胞释放的富含 miR - 181a - 5p 的 EVs 有关。

在众多参与基因调控的分子中，非编码 RNA（Noncoding RNAs，ncRNAs），特别是长链非编码 RNA（Long Noncoding RNAs，lncRNAs）和微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs），起着重要的作用。它们之间有着复杂的相互作用，有些 lncRNAs 能产生抑制靶 mRNA 的 miRNAs。比如 lncRNA H19 衍生的 miR - 675 可以抑制胰岛素生长因子受体（Insulin Growth Factor Receptor，Igf1r）的翻译，从而抑制细胞增殖；lncRNA MIR17HG 产生的 miR - 17～92 能减弱 TGF - β 信号，促进血管生成和肿瘤生长。而 lncRNA MIR181A1HG 作为 miR181a/b - 1 簇的主要基因，也能调节前体 miRNAs 和成熟 miRNAs 的表达，但它在 CRC 和肝转移过程中究竟扮演着什么角色，还不清楚。

为了揭开这个谜团，复旦大学附属中山医院等单位的研究人员在《Cell & Bioscience》期刊上发表了题为《The lncRNA MIR181A1HG in extracellular vesicles derived from highly metastatic colorectal cancer cells promotes liver metastasis by remodeling the extracellular matrix and recruiting myeloid - derived suppressor cells》的论文。他们发现，高转移性 CRC 细胞释放的富含 MIR181A1HG 的 EVs，能激活 HSCs，最终通过重塑 ECM 和招募髓源性抑制细胞（Myeloid - derived Suppressor Cells，MDSCs），促进 CRLM 的发生。这一发现不仅为 CRLM 的发病机制提供了新的见解，还为预测 CRC 患者发生继发性肝癌的风险提供了新的策略 。

研究人员为了开展这项研究，用了不少关键技术方法。他们用透射电子显微镜和差速超速离心法来验证外泌体（Exosomes，一种 EVs）的存在；通过体内和体外实验，来确定 EVs 中 MIR181A1HG 在 CRLM 中的作用；利用 RNA 下拉实验和双荧光素酶报告实验，来阐明 EVs 中 MIR181A1HG 调节 CRC 细胞和 HSCs 之间相互作用的机制 。

下面我们来详细看看他们的研究结果。

lncRNA MIR181A1HG 在 CRLM 中过表达，预示预后不良

研究人员首先对 90 对 CRC 组织和匹配的相邻正常组织进行研究，发现 MIR181A1HG 在 CRC 组织中的表达明显高于相邻正常组织。而且，III - IV 期 CRC 患者的 MIR181A1HG 表达，要比 I - II 期患者高得多。更重要的是，发生肝转移的 CRC 患者，其 MIR181A1HG 表达显著高于未发生肝转移的患者。在血清样本的 EVs 中，研究人员也得到了类似的结果：CRC 患者血清 EVs 中的 MIR181A1HG 表达，明显高于健康供体；III - IV 期 CRC 患者的 EVs 中，MIR181A1HG 表达又高于 I - II 期患者；有肝转移的 CRC 患者血清 EVs 里的 MIR181A1HG 表达，更是高于无肝转移的患者。

他们还发现，手术切除原发性 CRC 肿瘤和肝转移瘤一周后，患者血清 EVs 中的 MIR181A1HG 表达显著下降。通过 Kaplan - Meier 分析和对数秩检验，研究人员发现，MIR181A1HG 高表达与 CRC 患者较差的无病生存期（Disease - Free Survival，DFS）和总生存期（Overall Survival，OS）相关，而且在肝转移组中，高表达 MIR181A1HG 的患者 OS 明显缩短 。

MIR181A1HG 在 CRC 细胞来源的 EVs 中促进 CRLM，通过诱导肝脏前转移龛形成

研究人员检测了 7 种 CRC 细胞系条件培养基（Conditioned Medium，CM）中 MIR181A1HG 的表达，发现 HT29 和 SW480 细胞的 CM 中 MIR181A1HG 表达较低，而 RKO 和 SW620 细胞的 CM 中表达较高。进一步研究发现，MIR181A1HG 主要封装在 CRC 细胞来源的 EVs 中，尤其是高转移性 CRC 细胞分泌的 EVs。

为了探究 MIR181A1HG 在 CRC 细胞来源的 EVs 对 CRLM 的影响，研究人员进行了一系列实验。他们将转染了 MIR181A1HG 过表达或敲低质粒的 CRC 细胞系 HT29/RKO 的 EVs，与另一种 CRC 细胞系 HCT8 共培养，然后将 HCT8 细胞注射到裸鼠脾脏中建立 CRLM 小鼠模型，再将这些 EVs 注入小鼠尾静脉。结果发现，注射高转移性 CRC 细胞来源的 EVs 后，小鼠肝脏转移更多，OS 更差；而在 CRC 细胞来源的 EVs 中过表达或敲低 MIR181A1HG，能部分增强或减弱这些 EVs 对 CRLM 的促进作用。

通过 KEGG 分析，研究人员发现高、低 MIR181A1HG 表达的 CRC 肿瘤中差异表达的基因，与 MDSC 积累、ECM 沉积和 TGFβ 信号通路有关。进一步研究发现，过表达 MIR181A1HG 的 EVs 会增加 MDSCs 的积累，同时增加肝转移组织中 Ly6G?、α - SMA 和纤连蛋白的沉积和表达。而且，他们还证实了是 MDSCs 而非 T 细胞参与了 MIR181A1HG 介导的 CRLM 过程中 PMN 的构建 。

另外，研究人员还发现，MIR181A1HG 能通过 EVs 从 CRC 细胞转移到 HSCs，并且高转移性 CRC 细胞转移的 MIR181A1HG 数量更多 。

MIR181A1HG 转移到 EVs 中受 HNRNPA2B1 调控

RNA 通过 EVs 介导的转移需要特定的 RNA 结合蛋白。研究人员通过 RNA 下拉结合质谱分析，发现 HNRNPA2B1、IGF2BP2 和 HNRNPR 能与 CRC 细胞中的 MIR181A1HG 结合。但只有敲低 HNRNPA2B1 表达时，CRC 细胞来源的 EVs 中 MIR181A1HG 的表达才会明显下降，而细胞中总 MIR181A1HG 的表达不受影响。

miRNA 下拉实验表明，MIR181A1HG 和 HNRNPA2B1 在细胞质和 EVs 中结合，但不在细胞核中结合，而且突变 MIR181A1HG 的结合序列（GGAG）后，这种结合就会消失。细胞免疫荧光实验也显示，敲低 RKO 和 SW620 细胞中 HNRNPA2B1 的表达，能抑制 MIR181A1HG 通过 EVs 从高转移性 CRC 细胞转移到 HSCs 的过程 。

MIR181A1HG 在 CRC 细胞来源的 EVs 中作为 ceRNA，通过海绵吸附 miR373 - 3p，经 TGFβRII/Smad2/3 通路激活 LX2 细胞

研究人员通过 GO/KEGG 富集分析、TargetScan 数据库分析和 NCBI 序列比对，发现 TGFβ 信号通路可能参与 CRC 的发展，并且 MIR181A1HG 上有四个潜在的 miR373 - 3p 结合位点，TGFβRII 的 3’UTR 上也存在这些位点。他们推测 MIR181A1HG 可能通过竞争性结合 miR373 - 3p，减弱 miR373 - 3p 对 TGFβRII 3’UTR 的降解，从而激活 TGF - β/Smads 通路，最终激活 HSCs 。

为了验证这个推测，研究人员进行了一系列实验。他们构建了 MIR181A1HG 突变体和 miR373 - 3p 突变体质粒，通过 MS2 - RIP 实验、RNA 下拉实验、荧光素酶报告基因实验、AGO2 - RIP 实验和 qPCR 等实验，证实了 miR373 - 3p 能特异性结合 MIR181A1HG，并且 MIR181A1HG 在 CRC 来源的 EVs 中能海绵吸附 miR373 - 3p，可能作为 ceRNA 发挥作用 。

同时，研究人员还证实了 TGFβRII 是 HSCs 中 miR373 - 3p 的靶基因，MIR181A1HG 在 CRC 细胞来源的 EVs 中通过与 miR373 - 3p 的竞争性相互作用，调节 TGFβRII 的表达，并通过 TGF - β/Smad2/3 信号通路激活 HSCs 。

被 CRC 细胞来源的 EVs 中 MIR181A1HG 激活的 HSCs，通过重塑 TME 促进 CRLM

研究人员将与转染了 MIR181A1HG 过表达或敲低质粒的 HT29/RKO 细胞来源的 EVs 共培养的 LX2 细胞（一种正常的 HSC 细胞系），再转染 miR373 - 3p 模拟物或抗 miR373 - 3p，并分别用外源性 TGFβRII 或 TA - 02（一种 TGFβRII 的强效选择性抑制剂）处理。然后将 HCT8 细胞注射到裸鼠脾脏中建立 CRLM 小鼠模型，将条件培养基（CM）注入尾静脉。

结果发现，注射过表达 MIR181A1HG 的 CM 后，小鼠肝脏转移更多，OS 更差，而在 LX2 细胞中过表达或敲低 miR373 - 3p、使用 TA - 02 或外源性 TGFβRII，能部分减弱或增强这个过程。这表明 MIR181A1HG 在 CRC 细胞来源的 EVs 中能通过 TGF - β/Smad2/3 信号通路激活 HSCs，激活的 HSCs（α - HSCs）通过招募 MDSCs 和重塑肝脏中的 ECM，促进 CRLM 。

被 CRC 细胞来源的 EVs 中 MIR181A1HG 激活的 HSCs，通过分泌 CXCL12 招募 MDSCs 并重塑肝脏中的 ECM，促进 CRLM

趋化因子在肿瘤微环境中能调节细胞的迁移和黏附，促进癌症进展。研究人员推测 α - HSCs 可能通过分泌趋化因子促进 CRLM。通过人类趋化因子筛选试剂盒检测，他们发现 CCL15、CXCL5 和 CXCL12 是差异表达最显著的趋化因子，而且 MIR181A1HG 在 LX2 细胞中过表达时，CXCL12 的表达差异最大 。

进一步研究发现，过表达或敲低 MIR181A1HG 能部分增强或中和 HT29/RKO 细胞来源的 EVs 对 LX2 细胞分泌 CXCL12 的促进作用。抑制 CXCL12 能部分抵消被 MIR181A1HG 过表达的 CRC 细胞来源的 EVs 激活的 α - HSCs 对 CRLM 的增强作用，还能部分抵消 MIR181A1HG 在 CRC 细胞来源的 EVs 中招募 MDSCs 和重塑肝脏中 ECM 的能力 。

综合以上研究，研究人员得出结论：高转移性 CRC 细胞来源的 EVs 中的 lncRNA MIR181A1HG，作为 ceRNA 通过海绵吸附 miR373 - 3p，经 TGFβRII/Smad2/3 信号通路激活 HSCs。激活的 HSCs 通过重塑 ECM 和招募 MDSCs，在肝脏中启动 PMN 的形成，最终促进 CRLM 。

这个研究意义重大。目前，CRLM 的治疗面临着诸多挑战，虽然手术切除是潜在的治愈方法，但只有约 25% 的患者适合手术。探索 CRLM 的发病机制，开发新的治疗策略迫在眉睫。这项研究发现 MIR181A1HG 在高转移性 CRC 细胞来源的 EVs 中，是 CRLM 的预后因素和肝脏 PMN 形成的促进因子。针对 CRC 细胞来源的 EVs 中的 MIR181A1HG 或其调节的信号通路，可能为在 CRLM 早期抑制肝脏的促转移宿主反应提供新的策略，为 CRLM 的治疗带来新的希望 。