可编程RNA靶向CRISPR系统的进化起源：从RNA毒素-抗毒素系统到Cas13的演化之路

编辑推荐：本研究通过整合结构-序列进化追踪方法，揭示了RNA靶向CRISPR-Cas13系统起源于AbiF毒素-抗毒素(TA)系统的分子机制。研究人员发现Cas13e作为进化中间体兼具CRISPR和TA特性，并通过冷冻电镜解析AbiF RNP复合物结构，阐明了从非导向性RNase毒素演化为RNA引导的CRISPR系统的关键结构变化，为理解适应性免疫系统的进化提供了新范式。

　　在微生物与病毒的军备竞赛中，CRISPR-Cas系统作为原核生物的适应性免疫机制，其DNA靶向类型（如Cas9和Cas12）的进化起源已被阐明，但RNA靶向的Cas13系统的起源始终成谜。更令人困惑的是，这些系统如何获得可编程的RNA引导能力？这个问题的答案不仅关乎生命进化史的重构，更对开发新型基因编辑工具具有重要启示。

美国博德研究所张锋团队联合美国国立卫生研究院Eugene V. Koonin等研究者，通过创新的"结构-序列混合搜索"方法，在《细胞》发表的研究揭开了这一谜题。研究团队发现Cas13系统竟起源于一类古老的AbiF毒素-抗毒素系统，其中RNA分子原本作为抑制毒素活性的"解毒剂"，经过亿万年进化竟华丽转身成为指导靶向切割的"导航仪"。

关键技术方法包括：1) 对90亿原核生物蛋白质进行FLSHclust聚类和HH-suite谱分析；2) 结合AlphaFold2结构预测与DALI结构比对筛选同源蛋白；3) 冷冻电镜解析AbiF-核糖核蛋白复合体3.6?结构；4) 建立非冗余RNA-蛋白质关联数据库分析4,594,609,314个蛋白质；5) 体外酶活测定和细菌生长表型分析验证功能。

研究结果：
"追踪Cas13的祖先"：通过混合结构-序列搜索发现Cas13与AbiF蛋白的HEPN结构域存在环形排列（circular permutation）特征，系统发育分析表明Cas13a/c/d与F13a1/2、c13c1（后被命名为Cas13e）共同起源于AbiF分支。

"鉴定AbiF、F13a1和c13c1相关ncRNA"：发现88%的AbiF基因簇与29种非编码RNA（AbiFr）稳定关联，其5'端含有噬菌体匹配区域，提示参与宿主-病原体冲突。Cas13e的CRISPR RNA（crRNA）直接重复序列（DR）形成无错配的茎环结构，与AbiFr显著不同。

"Cas13e的生化特性分析"：证实Cas13e是迄今最小的VI型CRISPR系统（约500aa），具有RNA引导的RNA切割活性和典型的"附带切割"（collateral activity）特征。有趣的是，其apo状态显示基础RNase活性，crRNA结合后抑制该活性，靶RNA结合则激活切割，表现出介于TA和CRISPR系统的过渡特性。

"AbiF是含有RNA抗毒素的毒素"：功能实验证明AbiF的HEPN结构域（R²¹⁰和H²¹⁵催化残基）具有RNase毒性，而AbiFr ncRNA可中和毒性。预诱导ncRNA表达能完全消除AbiF的杀菌作用，符合III型TA系统特征。质粒成瘾实验显示该系统可稳定维持质粒遗传。

"AbiF RNase活性受ncRNA抑制的机制"：3.6?冷冻电镜结构揭示AbiF形成二聚体，每个单体结合一个AbiFr ncRNA分子。ncRNA的5'单链延伸精确插入HEPN活性位点，其保守茎环通过C³²-U³⁸凸起与蛋白质形成特异性相互作用。突变这些位点显著降低抑制效果，证实了结构-功能关联。

"Cas13 RNA引导核酸酶活性的进化"：进化轨迹显示AbiF首先发生基因复制产生双HEPN结构，随后逐步获得crRNA结合能力。关键的转折点是REC结构域（识别区）的插入，使系统从非特异性RNase转变为能识别guide-target RNA双链的定向切割系统。Cas13e保留的apo状态活性提示其处于进化过渡阶段。

这项研究不仅解决了CRISPR生物学领域的关键进化谜题，更展示了生命如何通过分子"改装"实现功能创新——古老的毒素防御系统通过结构域插入和RNA伙伴的重编程，演化为精密的可编程基因工具。从应用角度看，理解Cas13的进化路径有助于设计更小型化的RNA编辑系统，而AbiF-ncRNA的抑制机制可能启发新型RNA治疗策略。在基础科学层面，该研究为其他RNA引导系统的起源探索提供了方法论范例，彰显了整合计算预测与实验验证在进化生物学研究中的强大力量。