增强 HDR 介导的 COL7A1 杂合突变校正用于隐性营养不良性大疱性表皮松解症的治疗研究

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Enhanced HDR-mediated correction of heterozygous COL7A1 mutations for recessive dystrophic epidermolysis bullosa

为解决基因编辑同源定向修复（HDR）效率低及位点间差异大的问题，研究人员开展针对隐性营养不良性大疱性表皮松解症（RDEB）的基因编辑研究。结果显示，该策略可使原代 RDEB 角质形成细胞和 fibroblasts 的 HDR 率分别达 75% 和 32%，有望推动个性化基因治疗。

　　在医学的奇妙世界里，有一种名为隐性营养不良性大疱性表皮松解症（Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa，RDEB）的罕见病正困扰着许多患者。RDEB 是一种遗传性皮肤疾病，患者的皮肤和黏膜异常脆弱，轻轻一碰就会出现严重且难以愈合的水疱，这给他们的生活带来极大痛苦。目前，针对 RDEB 还没有永久性的治愈方法。虽然各种治疗策略正在研究中，但从根源上纠正致病突变才是实现长期治疗的理想方案。在众多研究方向中，CRISPR-Cas9 基因组编辑系统因其成本低、编辑能力强大而备受关注。它就像一把 “基因剪刀”，能精准地对基因进行切割和修改。然而，利用同源定向修复（Homology-Directed Repair，HDR）进行基因编辑时，存在效率低和位点间差异大的问题，这就像在错综复杂的基因迷宫中，“剪刀” 总是找不到正确的路线，导致无法广泛应用于个性化治疗。

为了攻克这些难题，来自新西兰奥克兰大学（The University of Auckland）等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们希望通过开发一种高效且通用的基因编辑策略，来提高 HDR 的效率，为 RDEB 患者带来新的希望。研究人员聚焦于三个此前基因疗法未针对的 RDEB 致病 COL7A1 突变，通过一系列实验，取得了令人瞩目的成果。这一研究成果发表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》杂志上，为 RDEB 的治疗开辟了新的道路。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先，从三名 RDEB 患者的皮肤样本中获取原代角质形成细胞和 成纤维细胞（fibroblasts）。然后，设计针对特定突变的单导向 RNA（single-guide RNAs，sgRNAs）和短单链寡核苷酸模板（single-stranded oligonucleotide templates，HDR templates），并将其与 Cas9 核酸酶核糖核蛋白（RNP）通过电穿孔的方式导入细胞。同时，使用牛津纳米孔技术测序（Oxford Nanopore Technology sequencing，ONT-seq）结合 CRISPResso2 分析流程来评估基因编辑的效果 ，通过这种技术组合，能够准确地分析基因编辑的情况。

下面来看具体的研究结果：

• CRISPR 单导向 RNA 和 HDR 模板的设计：研究人员对来自三名新西兰 RDEB 患者的细胞进行研究，针对他们各自 COL7A1 基因上的不同突变，设计了相应的 sgRNAs 和 HDR 模板。这些模板旨在将致病突变恢复为野生型序列，并在 gRNA 的原间隔相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）位点引入阻断突变，防止 HDR 后再次切割。例如，针对 RDEB01 患者的 c.2278_2279del 突变、RDEB03 患者的 c.8698_8708del 突变以及 RDEB05 患者的 c.3551 - 3T>G 突变，都精心设计了对应的编辑试剂。
• 靶向编辑分析流程的验证：为了准确分析基因编辑效果，研究人员采用 ONT - seq 和 CRISPResso2 分析流程。以 RDEB03 患者来源的角质形成细胞为例，通过与传统的桑格测序（Sanger sequencing）对比发现，该流程在检测杂合突变时表现更优，能够更准确地分析未编辑等位基因、插入缺失（indels）和 HDR 事件。同时，通过分析特定单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在编辑后的分布情况，验证了 HDR 事件在野生型（WT）和突变型（MUT）等位基因上的分布是均等的。
• 小分子抑制对基因编辑效率的影响：研究发现，使用小分子抑制剂 M3814 抑制 DNA 激活蛋白激酶（DNA - activated protein kinase，DNA - PK），能显著提高原代 RDEB 细胞的靶向基因编辑效率。在 RDEB03 患者的角质形成细胞和 fibroblasts 中，加入 M3814 后，HDR 率明显上升，同时 indels 的比例下降。而且，不同设计的 HDR 模板对 HDR 率的影响存在差异，在 RDEB03 和 RDEB05 患者来源的细胞中，低 SNP 模板的 HDR 效率更高。在低传代的 RDEB03 角质形成细胞中，使用低 SNP HDR 模板并结合 M3814 进行编辑，HDR 率可高达 74.8%。
• HDR 介导的基因修复对 C7 表达的影响：研究人员对编辑后的细胞进行分析，发现 HDR 介导的基因修复能使大量编辑的 RDEB 角质形成细胞中 C7 蛋白高水平表达。通过免疫细胞化学和流式细胞术分析，发现编辑后的细胞中 C7 阳性细胞比例显著增加，且基因校正细胞的 C7 表达水平与 HDR 率呈强线性相关。在 3D 双层皮肤模型中，编辑后的 RDEB 细胞能恢复 C7 的正常表达和正确定位，这表明编辑后的细胞在皮肤模型中能发挥正常功能。
• 双切口酶介导的 HDR 效果评估：研究人员尝试使用双切口酶策略来提高编辑的特异性，针对 RDEB03 患者的 c.8698_8708del 突变进行编辑。结果发现，虽然 M3814 能增强双切口酶介导的 HDR 率，但会导致频繁的大的靶向缺失和转录模式改变。与 Cas9 核酸酶策略相比，双切口酶策略产生的 indels 和大的缺失较多，因此 Cas9 核酸酶策略更适合该位点的编辑。

综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。它成功开发了一种高效的体外 HDR 编辑方法，在原代人皮肤细胞中实现了对 COL7A1 杂合突变的有效编辑。治疗性 HDR 率超过 40%，且无需对每个位点进行过多优化。这一成果为 RDEB 以及其他由 COL7A1 基因突变引起的疾病提供了新的治疗思路和方法，也为基因编辑技术在个性化治疗中的应用奠定了更坚实的基础，有望推动相关领域的进一步发展，为更多患者带来治愈的希望。