mRNA-LNP 疫苗佐剂策略：打破肝脏免疫耐受，开启肝病治疗新篇

为解决肝脏免疫耐受导致对感染或恶性肿瘤免疫反应不佳的问题，研究人员开展了关于 mRNA-LNP 疫苗佐剂策略的研究。结果发现不同佐剂对非实质肝细胞有不同影响，且需平衡免疫调节与 mRNA 翻译效率。这为增强肝脏相关疾病免疫力提供了思路。

　　在人体的健康防线中，肝脏占据着极为重要的位置，它不仅是物质代谢的核心枢纽，更是免疫系统的关键一环。然而，肝脏有个 “特殊本领”，那就是常常产生免疫耐受，这一特性使得它在面对病原体时，免疫反应往往被抑制。打个比方，肝脏就像一座 “城堡”，原本的免疫细胞是 “卫士”，但免疫耐受却让这些 “卫士” 在面对敌人（病原体）时变得有些 “懈怠”，无法有效地发起攻击。这种情况在感染性疾病和癌症的治疗中，成为了巨大的阻碍。比如说在肝癌的治疗过程中，肝脏的免疫耐受使得免疫细胞难以识别和清除癌细胞，导致病情难以得到有效控制；在乙肝等慢性肝病中，免疫耐受也让病毒得以长期在肝脏内 “潜伏”，持续损害肝脏健康。

为了打破这一困境，来自德国美因茨约翰内斯?古腾堡大学医学中心儿童医院等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们聚焦于佐剂化脂质纳米颗粒包裹的 mRNA 疫苗（mRNA-LNP），试图探索其克服肝脏免疫耐受的有效策略。该研究成果发表在《Molecular Therapy Methods 》杂志上。

研究人员为开展此项研究，运用了多个关键技术方法。首先是动物实验技术，选用野生型 C57BL/6JRj 小鼠以及转基因 OT-I 和 OT-II 小鼠，在严格的实验条件下进行饲养和实验操作。其次是细胞分离与培养技术，通过肝脏灌注和特定试剂盒分离小鼠肝脏非实质细胞（NPCs），并进行体外培养和刺激实验。最后利用了多种检测技术，如流式细胞术检测细胞表面标志物表达，细胞因子 / 趋化因子分析技术（CBA）测定细胞培养上清中细胞因子和趋化因子浓度等。

研究结果如下：

1. 佐剂对肝脏 NPCs 的影响：研究人员测试了 R848、Poly I:C 和 cGAMP 这三种佐剂对不同肝脏 NPCs 群体的激活能力。通过评估共刺激标志物 CD80 和 CD86 的表达发现，R848 能显著上调 CD45⁺CD11c⁺ DCs 中 CD86 和 CD80 的表达，对 CD45⁺CD32b⁺ LSECs 也有类似效果；Poly I:C 和 cGAMP 对 LSECs 的 CD86 表达有轻微促进作用；而在 CD45⁺F4/80⁺ KCs 中，只有 R848 能上调 CD80 表达。这表明不同佐剂对不同 NPCs 群体的激活作用存在差异。
2. 联合佐剂的效果：研究人员在体外将 Poly I:C、R848 和 / 或 cGAMP 联合处理 NPCs 群体。结果显示，联合佐剂处理常呈现出叠加效应。例如，在 KCs 中，cGAMP 与 R848 或 Poly I:C 联合处理，可使 CD86 表达有可检测到的增加；在 DCs 和 LSECs 中，联合佐剂处理也能显著提高 CD80 和 CD86 的表达水平。同时，联合佐剂处理还能促进细胞因子和趋化因子的分泌。这说明联合佐剂能更有效地刺激免疫反应。
3. 佐剂刺激 T 细胞增殖：研究人员将卵清蛋白（OVA）反应性 CD8 和 CD4 T 细胞与 OVA 蛋白或肽脉冲的 NPCs 共培养。结果发现，经 R848 加 cGAMP 预处理的 OVA 刺激的肝脏 NPC 培养物中，CD8⁺ T 细胞增殖更高；在 CD4 T 细胞方面，R848 与 cGAMP 或 Poly I:C 联合刺激可促进其增殖。这表明佐剂能增强 NPCs 刺激 T 细胞增殖的能力。
4. 小鼠非实质肝细胞对 OVA mRNA-LNPs 与佐剂联合给药的反应：给小鼠静脉注射负载 OVA 的 mRNA-LNP（LNPs-OVA）与佐剂后发现，单独的 LNPs-OVA 无法上调 KCs、DCs 或 LSECs 中 CD86 或 CD80 的表达；而 LNPs-OVA 与 cGAMP 或 cGAMP 和 R848 联合给药可上调这些共刺激分子的表达。同时，联合佐剂给药能促进 NPCs 分泌细胞因子和趋化因子。这说明佐剂与 mRNA-LNP 联合使用可增强对肝脏 NPCs 的激活作用。
5. R848 对 LNP 包裹的 mRNA 翻译的影响：将 R848 与 Luc mRNA-LNP 混合后静脉注射到小鼠体内，通过检测荧光素酶活性发现，R848 显著降低了 Luc 表达，而 cGAMP 对翻译的影响较小。这表明 R848 会对 mRNA 翻译产生负面影响。
6. 重复给予 Ova mRNA-LNP 联合佐剂的免疫反应：对小鼠进行三次静脉注射 LNPs-OVA 联合佐剂的免疫研究发现，重复注射后肝脏 NPCs 的激活标记物没有显著上调，而脾细胞对佐剂处理反应更明显。在抗原特异性免疫反应方面，R848 与 LNPs-OVA 联合给药可增强 CD8⁺ T 细胞的细胞因子分泌，R848/cGAMP 联合处理可增加 CD4⁺ T 细胞分泌细胞因子的水平。此外，所有处理组的抗 OVA 抗体滴度无差异，R848 和 R848/cGAMP 联合处理不会增加 T_reg细胞数量。这表明重复注射佐剂化的 LNPs-OVA 会产生不同的免疫反应。

研究结论和讨论部分指出，肝脏免疫与自我耐受之间的平衡十分复杂，非实质肝细胞在其中起着重要作用。佐剂组合，尤其是 R848 与 cGAMP 或 Poly I:C 联合使用，可协同增强免疫反应，但所有佐剂组合都无法激活 KCs。佐剂与 mRNA-LNP 联合应用可增强先天免疫激活，不过在选择佐剂时，需要平衡其对 mRNA 翻译的影响和免疫刺激特性。这一研究为优化针对肝脏疾病的免疫治疗策略提供了重要依据，有助于开发更有效的治疗肝癌、慢性肝病感染（如乙肝）等疾病的方法，在肝脏疾病治疗领域具有重要的意义，为未来的临床治疗开辟了新的方向。