非病毒睡美人转座子制备人 CAR-T 细胞用于 B 细胞恶性肿瘤：成本效益与临床潜力

为解决 CAR-T 疗法成本高昂等问题，研究人员开展了利用非病毒睡美人（SB）转座子制备靶向 CD19 的 CAR-T 细胞（TranspoCART19 细胞）的研究。结果显示，该细胞体外和体内抗肿瘤疗效与传统慢病毒载体制备的 CAR-T 细胞相似，且安全性良好，这为 CAR-T 细胞疗法提供了更经济有效的方案。

　　近年来，癌症治疗领域取得了诸多突破，其中免疫疗法中的嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T 细胞）疗法备受瞩目。CAR-T 细胞疗法就像给 T 细胞装上了精准导航的 “导弹”，能够识别并攻击癌细胞，在治疗血液系统恶性肿瘤方面效果显著，像 B 细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等疾病，已经有多种 CAR-T 细胞产品获批上市。然而，这一疗法并非完美无缺，目前其高昂的成本成为了广泛应用的 “拦路虎”。CAR-T 细胞的制备大多依赖整合病毒载体进行基因工程改造，生产这些病毒载体不仅过程复杂，而且成本极高，这使得国家卫生系统在面对大量患者时压力巨大。此外，病毒载体还存在恶性转化的潜在风险，这也让科研人员忧心忡忡。为了解决这些问题，来自西班牙和德国等多地研究机构的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Molecular Therapy Methods 》杂志上。

研究人员为了找到更安全、经济且有效的 CAR-T 细胞制备方法，将目光投向了非病毒载体 —— 睡美人（SB）转座子系统。他们以 CD19 为关键靶点，制备出了一种名为 TranspoCART19 的细胞产品，这是一种融合了截断版人表皮生长因子受体（hEGFRt）作为报告基因和安全开关的 4 - 1BB 第二代 CAR-T 细胞。

在研究过程中，研究人员使用了多种关键技术方法。样本队列来源于健康供体（HDs）和患有 B 血液系统恶性肿瘤的患者。细胞系培养用于后续实验，通过密度梯度离心等方法分离细胞，利用电穿孔技术将 SB 转座子系统导入细胞，借助流式细胞术对细胞进行表型和功能分析，运用数字液滴 PCR（ddPCR）测定载体拷贝数（VCN），通过整合位点分析（ISA）研究转座子在基因组中的插入情况，还进行了体内实验评估细胞的抗肿瘤效果和安全性。

研究结果如下：

1. TranspoCART19 细胞生产的优化：研究人员对 TranspoCART19 细胞的生产条件进行了优化。他们评估了不同的电穿孔系统，最终选择了 MaxCyte ExPERT GTx 系统，因为该系统转染率更高且变异性更低。同时，确定了每106个细胞使用 0.5mg 微型环（MC）和 0.5mg SB100X mRNA 的最佳比例，此比例能保证较高转染效率的同时，不影响细胞活力和回收率。此外，添加细胞因子（IL - 7 和 IL - 15）可显著促进细胞扩增，且不影响 CAR⁺细胞的比例。
2. TranspoCART19 细胞的表型和功能特征：对 TranspoCART19 细胞进行表型和功能鉴定时发现，健康供体和患者来源的细胞在扩增倍数和 CAR-T 细胞比例上无显著差异。总体上，CD4⁺群体中的 CAR-T 细胞比例略高于 CD8⁺细胞。患者来源的 TranspoCART19 细胞具有更分化的表型，效应记忆 T 细胞比例更高。功能研究表明，TranspoCART19 细胞对 CD19⁺肿瘤细胞具有高效且特异性的细胞毒性，并且仅在与 CD19 表达肿瘤细胞共培养时才产生促炎细胞因子。在体内实验中，TranspoCART19 细胞显著提高了荷瘤小鼠的生存率，与慢病毒载体（LV）制备的 CAR-T 细胞疗效相似。
3. 临床级 TranspoCART19 细胞的制造和表征：研究人员在两个不同实验室进行了临床级 TranspoCART19 细胞的放大生产和验证。从健康供体的新鲜样本出发，按照优化条件进行生产，结果显示两个实验室的细胞生长、扩增速率以及 CAR-T 细胞比例和表型特征相似。最终的产品符合所有临床应用的放行标准，细胞活力高、无菌、无内毒素和支原体污染。
4. TranspoCART19 细胞的安全性分析：安全性分析是研究的重要部分。结果显示，TranspoCART19 细胞产品的 VCN 平均值为 5.16 拷贝 / 细胞，低于 15 拷贝 / 细胞的限制标准。其转座子插入呈现接近随机的分布，在癌症相关基因和外显子中的富集程度较低，且在基因组安全港（GSH）位点的整合比例显著高于 LV 制备的 CAR-T 细胞。此外，最终产品中不含转座酶蛋白和非整合的 MC。hEGFRt 作为安全开关，在给予西妥昔单抗后能有效清除体内的 CAR-T 细胞。生物分布研究表明，TranspoCART19 细胞主要分布在造血器官，无性别差异。

综上所述，研究人员成功优化了一种成本效益高且可重复性的 GMP 级 TranspoCART19 细胞制造工艺。这种细胞不仅具有完全的功能特性和抗肿瘤疗效，还具备良好的安全性。该研究成果为 CAR-T 细胞疗法提供了一种新的选择，有望降低治疗成本，推动 CAR-T 细胞疗法在临床中的更广泛应用。目前，基于这些研究结果，一项评估 TranspoCART19 细胞治疗复发 / 难治性淋巴瘤可行性、安全性和抗肿瘤疗效的临床试验（NCT06378190）正在进行中，这无疑为众多癌症患者带来了新的希望。