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为解决幼稚人多能干细胞（hPSCs）印记被侵蚀的问题，研究人员开展了追踪印记擦除动态及寻找减轻策略的研究。结果发现调整 MEK/ERK 抑制水平和过表达 ZFP57 可保护印记，二者联用效果更佳。这为 hPSCs 研究及应用提供了重要进展。
在生命科学的奇妙世界里，细胞就像一个个神秘的小精灵，各自承担着独特的使命。其中，幼稚人多能干细胞（hPSCs）备受瞩目，它能模拟植入前的上胚层，为研究早期人类发育提供了宝贵的模型。然而，这个 “小精灵” 却存在一个棘手的问题：在目前的培养条件下，其携带的父母特异性表观遗传标记（印记，imprints）会逐渐被侵蚀。
印记对于正常的生长发育至关重要，它如同细胞中的 “小管家”，精准调控着基因的表达。在小鼠研究中发现，印记基因从母本或父本等位基因表达，对胚胎和胚外组织的发育不可或缺。在人类中，约 200 个印记基因若出现异常，可能引发生长受限、肥胖、智力障碍、行为异常，甚至增加患某些癌症的风险。而且，印记异常还会导致非人类灵长类动物体细胞核移植胚胎出现发育缺陷。
此外，hPSCs 印记异常阻碍了对细胞谱系特化的发育研究，也限制了其在再生医学中的应用。此前虽有研究关注培养的多能细胞中的印记丢失（LOI），但大多无法实时监测活细胞培养中的印记完整性。为了攻克这些难题，来自华盛顿大学医学院等机构的研究人员展开了深入探索，相关研究成果发表在《Stem Cell Reports》上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先利用 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑技术，在 H9 人胚胎干细胞（hESCs）的 SNRPN 基因座构建双色荧光报告基因；通过流式细胞术（Flow cytometry）和荧光激活细胞分选（FACS）对细胞进行分析和分选；采用甲基化特异性多重连接依赖探针扩增（MS-MLPA）和全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）检测 DNA 甲基化；借助 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达。
研究结果如下：
- 活细胞报告基因 hPSC 系显示等位基因特异性 SNRPN 表达：研究人员在 H9 hESCs 的 SNRPN 基因座插入 P2A-mRuby3 和 P2A-EGFP 序列，构建了 H9-SNRPN-mRuby3-EGFP（H9-SRG）细胞系。在诱导幼稚化过程中，多数细胞的 SNRPN 从单等位基因表达转变为双等位基因表达，且这种转变不可逆。同时发现，双等位基因表达的细胞在重新诱导为植入后样多能状态时，生长处于劣势。
- SNRPN 报告基因活性与 SNURF 基因座的甲基化相关，是全球甲基化水平的指标：通过对不同状态下的细胞进行 MS-MLPA 和 WGBS 分析，发现 SNRPN 报告基因活性与最近的差异甲基化区域（DMR）的甲基化相关性最强。同时，报告基因活性与全球 5 - 甲基胞嘧啶（5mCG）水平相关，可用于推断相对全球甲基化水平。
- 调节幼稚培养条件以增强印记稳定性：由于目前诱导幼稚化需要抑制 FGF 通路，研究人员尝试降低 FGF 通路抑制程度。去除 ERK1/2 抑制剂（ERKi）GDC-0994 虽能防止印记丢失，但无法诱导真正的幼稚多能状态。双滴定 MEK1/2 抑制剂（MEKi）PD0325901 和 GDC 发现，降低 MEK/ERK 抑制可使部分细胞进入保留印记的幼稚状态，但该状态持续时间较短。
- 通过过表达候选印记保护因子增强印记稳定性：研究人员筛选了多个候选印记保护因子，发现只有过表达 ZFP57 能在诱导幼稚化过程中保护部分印记。而且，ZFP57 过表达还能促进细胞增殖或存活。将 ZFP57 过表达与 MEKi/ERKi 滴定两种策略结合，能更有效地保护印记。
研究结论和讨论部分指出，本研究构建的双色荧光报告细胞系（H9-SRG）可在单细胞分辨率下追踪印记擦除动态，为评估印记保护策略提供了有力工具。降低 MEK/ERK 抑制水平或过表达 ZFP57 都能保护部分印记，二者联合使用效果更显著。这一研究成果为提高幼稚 hPSCs 的印记保真度，推动其在人类发育和再生研究中的应用迈出了重要一步。未来，还需进一步探究其他因素对印记稳定性的影响，以及如何更好地利用这些发现优化 hPSCs 的培养和应用。
