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为解决大豆抗毒素（glyceollin）生物合成最后一步的酶及机制不明问题，研究人员开展了相关研究。他们鉴定出 3 种细胞色素 P450（P450）环化酶，明确其功能。这为大豆抗毒素生物制造及大豆抗性育种提供新方向，意义重大。
在农业领域，大豆的健康生长至关重要。大豆抗毒素（glyceollin）作为一种由大豆产生的异黄酮衍生代谢物，不仅在改善人类和动物健康方面极具潜力，有望替代抗生素减少食品供应中的耐药微生物；还在农业生产中发挥着关键的防御作用，能够抵御病原体，防止大豆因病害造成全球范围内每年数十亿美元的产量损失。然而，尽管人们对大豆抗毒素的研究已取得一定进展，但其生物合成途径中最后一步的催化酶，即大豆抗毒素合酶（GS），一直以来都未被明确，其精确的环化机制也如同迷雾一般，这严重阻碍了对大豆抗毒素更深入的研究和应用。
为了揭开这一谜团，来自加拿大农业与农业食品部伦敦研究与发展中心、西安大略大学、约克大学的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Molecular Plant》上，具有重要的科学意义。
研究人员运用了多种关键技术方法。在基因筛选方面，利用大豆 - 大豆疫霉（Phytophthora sojae）转录组数据集，筛选出相关候选基因；通过共表达分析，确定基因间的关联。在功能验证上，采用体外酶活性检测，以酵母微粒体为载体，用大豆抗毒素前体物质作为底物来检测候选酶的功能；还通过基因沉默和过表达技术，在大豆发根中监测对大豆抗毒素积累的影响。
候选基因筛选
研究人员从大豆 - 大豆疫霉相互作用的 5 个公开转录组数据集入手，分析不同时间点感染样本的基因表达情况，这些样本来自抗性不同的大豆品种。在此过程中，他们发现了 21 个在所有 5 项转录组研究中均上调的常见大豆细胞色素 P450（GmP450）基因。经过筛选，排除已被表征的基因，如异黄酮合酶（IFS）、肉桂酸 4 - 羟化酶（C4H）等，最终确定了 16 个由 15 个基因编码的 GmGS 候选基因，为后续研究奠定了基础。
共表达网络分析
对 15 个 GmGS 候选基因、71 个大豆抗毒素生物合成途径基因以及 346 个 GmP450 基因进行共表达分析。利用包含 10 个转录组生物项目的大豆表达图谱 v2，根据样本中基因对之间的相关性计算共表达分数。结果显示，共得到 118 个具有显著系数（r ≥0.6）的基因并构建网络。其中，两个主要网络和几个次要网络被发现，在主网络的 6 个 GmGS 候选基因中，GmGS11A、GmGS11B 和 GmGS13A 形成紧密网络，与多个大豆抗毒素生物合成基因显著相关，这表明它们在大豆抗毒素生物合成中可能具有重要作用。
体外酶活性检测
以酵母微粒体为实验体系，表达候选 GmGSs，分别以 glyceocarpin 和 glyceollidin 为底物进行体外酶活性检测。结果发现，GmGS11A 和 GmGS11B 能够特异性地将 glyceollidin 转化为大豆抗毒素 I，而 GmGS13A 则能将 glyceocarpin 转化为大豆抗毒素 III。通过高分辨率质谱分析，确定 GmGS11A 和 GmGS11B 的主要酶促产物与合成的大豆抗毒素 I 标准品具有相同的保留时间和分子式（C20H18O5 ，m/z 321.1121，[M - H2O + H]+）；对于 GmGS13A，由于没有大豆抗毒素 III 的标准品，研究人员从感染的大豆根中纯化出该物质并经核磁共振（NMR）分析验证，确定其反应产物为大豆抗毒素 III，其化学性质也符合相应特征。
体内功能验证
通过基因沉默和过表达技术，在大豆发根中进一步验证这 3 种 GmP450 的功能。同时沉默 GmGS11A 和 GmGS11B 后，多个独立转基因株系中它们的转录本和大豆抗毒素 I 代谢物减少，而大豆抗毒素 II 和 III 的含量未改变；沉默或过表达 GmGS13A，分别使大豆抗毒素 III 的含量显著降低或增加，但对大豆抗毒素 I 和 II 无显著影响。此外，过表达 GmGS11B 不仅使大豆抗毒素 I 含量增加，还使大豆抗毒素 II 水平上升，基于此推测植物中存在特定因子改变 GmGS11B 的区域特异性以产生大豆抗毒素 II 。
综合以上研究，研究人员成功鉴定出长期以来推测的催化大豆抗毒素生物合成最终步骤的 P450 酶，明确了它们的功能。这一发现不仅揭示了植物 P450 家族的催化多样性，为在微生物或植物系统中生物制造具有药用价值的大豆抗毒素提供了新的可能；还将极大地加速大豆抗性育种新分子标记的鉴定，对大豆的基础研究和农业生产应用都有着深远的意义。
