综述：泛素化和线粒体导入调控的多种线粒体自噬途径

本文聚焦线粒体自噬，详细阐述 PINK1/Parkin 和 NIX/BNIP3 两条关键途径（均受泛素化和线粒体蛋白导入调控）。前者在清除受损线粒体中作用关键，后者与发育、分化相关。还探讨了相关未解问题，为线粒体自噬研究提供重要参考。

　　

线粒体自噬的重要意义与研究背景

线粒体在真核细胞中地位非凡，不仅是能量转换和代谢的关键场所，还参与多种信号传导，甚至在特定情况下决定细胞的命运。它如同细胞内的 “变色龙”，能依据环境和细胞代谢需求改变自身状态，肿瘤细胞的糖酵解转换（“Warburg 效应”）以及神经元成熟时依赖氧化磷酸化就是典型例子。

线粒体自噬（mitophagy）作为选择性清除线粒体的过程，对维持线粒体健康种群、促进细胞适应性和发育变化至关重要。自 2000 年代以来，三项重大进展推动了该领域的飞速发展：一是发现了选择性自噬途径，让人们认识到细胞内不同结构可借助核心自噬机制进行清除；二是明确了泛素化（ubiquitylation）除了介导蛋白酶体降解外的多种功能，以及自噬衔接蛋白在连接泛素化货物与自噬体膜中的作用；三是揭示了帕金森病相关蛋白 PINK1 和 Parkin 与受损线粒体表面泛素化级联反应的关联，这种反应最终促使线粒体通过线粒体自噬被清除。

研究发现，利用荧光报告基因在小鼠和果蝇中观察到，机体中的大部分线粒体自噬通常不依赖 PINK1/Parkin 途径，不过骨骼肌是个例外。由 BNIP3 和（或）NIX（也称为 BNIP3L）表达水平调控的另一种途径，在许多组织的线粒体自噬中可能发挥重要作用。此外，FUNDC1 和 BCL2L13 介导的途径也可能参与其中，但目前对它们的具体贡献还缺乏系统研究。本文将重点探讨 Parkin 和 BNIP3/NIX 途径，尤其是它们对泛素化和线粒体蛋白导入的不同依赖关系。

PINK1 - Parkin 线粒体自噬途径的核心要点

PINK1/Parkin 途径的众多分子细节已通过精细的细胞生物化学和结构生物学研究得以阐明。PINK1 是一种激酶，当线粒体去极化时，它会在其上积累，并能磷酸化泛素以及泛素 E3 连接酶 Parkin 的 Ser65 位点。随后，Parkin 从细胞质转移到线粒体，在 PINK1 的作用下发生构象变化并被激活，进而对线粒体外膜（OMM）蛋白进行广泛的泛素化修饰。

泛素结合衔接蛋白如视神经蛋白（optineurin，OPTN）和核点蛋白 52（nuclear dot protein 52，NDP52）会被招募到线粒体，它们通过识别与磷脂酰乙醇胺结合的微管相关蛋白 1 轻链 3（microtubule - associated protein 1 light chain 3，LC3），招募 TANK 结合激酶 1（TANK - binding kinase 1，TBK1），并与 ULK1 激酶复合体的 FIP200 成分相互作用，从而将线粒体与自噬膜连接起来，启动线粒体自噬过程。

PINK1 的积累机制

在基础状态下，PINK1 的半衰期约为 30 分钟。新合成的 PINK1 首先通过受体亚基 TOM70 与线粒体外膜导入（TOM）复合体结合，随后依次通过 TOM 和线粒体内膜导入 TIM17/TIM23 通道。在这个过程中，PINK1 会经历两次切割，先是在线粒体基质中被切割，然后在跨膜（TM）结构域被线粒体内膜蛋白酶 PARL 切割，最终产生的 55kDa 片段（cPINK1）在蛋白酶体抑制或 E1 泛素激活酶 UBA1 抑制时会积累。

以往认为线粒体去极化是 PINK1 积累的触发因素，但现在看来，它更像是对线粒体导入应激的一种反应。比如，线粒体基质中错误折叠蛋白的积累或线粒体导入功能的丧失，即使在线粒体能量状态正常时，也会导致 PINK1 积累。在这些情况下，稳定状态的 PINK1 会与 TIM17/TIM23 转运体蛋白结合，形成 PINK1 - TOM - TIM 超复合体，而在无应激条件下，这种复合体是检测不到的。

结构研究表明，PINK1 的一个螺旋结构（靠近全长蛋白的 TM 结构域，虽被称为 N 端（NT），但实际位置特殊）与 C 端延伸（CTE）相互作用，这种相互作用对于 PINK1 与 TOM 复合体的结合以及其自身的活性至关重要。最近，研究人员在酿酒酵母中通过共表达人 PINK1 和人 TOM 复合体的七个亚基，成功构建了一个重组系统来研究 PINK1 的激活机制。研究发现，缺失 TOM5 和 TOM6 对 PINK1 激活无影响，而缺失 TOM7 和 TOM22 则会完全阻断 PINK1 激活，这与它们在核心 TOM40 孔复合体组装和维持中的作用相符。此外，缺失 TOM20 和 TOM70 会降低 PINK1 激活，这两个亚基被认为具有调节受体结合的功能。利用 AlphaFold 3.0 构建的模型预测，PINK1 的 NT - CTE 界面会直接与 TOM20 暴露在细胞质的 C 端一半区域相互作用。

值得注意的是，线粒体膜电位并非 PINK1 切割的绝对必要条件。在缺乏 TOM7 或无法与 TIM17/TIM23 复合体结合时，TM 结构域的切割可通过替代蛋白酶 OMA1 进行，OMA1 最近被认为能将未能成功导入的蛋白从线粒体中释放出来。而腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）复合体与 TIM44 的结合，对于 PINK1 与 TIM17/TIM23 复合体的结合至关重要，缺乏 ANT 时，即使使用质子载体使线粒体去极化，PINK1 仍会被降解。在人类视网膜色素上皮（RPE1）细胞中，研究发现线粒体去极化后，新合成的 PINK1 中只有不到 50% 会进入稳定状态的 Pool，且膜去极化后 PINK1 的积累不能完全用稳定性增加来解释，因为 PINK1 mRNA 水平并未改变，所以推测可能是 PINK1 的翻译增加，这或许与线粒体定位的 mRNA 池的动员有关。有研究观察到，在神经元中，PINK1 mRNA 会与突触结合的线粒体一起运输，PINK1 与突触蛋白 2（synaptojanin 2，SYNJ2）的 RRM 结构域结合，而 SYNJ2 通过与线粒体外膜跨膜蛋白 SYNJ2BP 结合，将线粒体锚定在特定位置，这为 PINK1 的局部翻译提供了证据，也表明局部翻译可能是在远离细胞体的部位维持 PINK1 依赖的线粒体自噬的一种机制。

PINK1 触发阈值的调控

PINK1 与 TOM 通道的结合还有其他重要影响。PINK1 - Parkin 泛素化级联反应的第一步是 PINK1 依赖的泛素磷酸化，这会促进 Parkin 的招募。TOM 复合体的一些蛋白及其紧密相关蛋白会被锚定在线粒体外膜的 E3 连接酶 MARCH5 和 MUL1 以及可能从细胞质招募的其他 E3 连接酶进行泛素化修饰。在激活 Parkin 活性之前，这些泛素化修饰的蛋白可能是激活的 PINK1 的首选底物。它们的泛素化状态受线粒体去泛素化酶 USP30 的调节，而这种状态会决定它们触发 Parkin 泛素化级联反应的敏感性。因此，USP30 成为了一个具有潜在治疗意义的靶点，目前正在进行针对帕金森病和急性肾损伤的临床试验。

BNIP3 和 NIX 的关键作用

线粒体外膜相关蛋白 BNIP3 和 NIX 属于 BH3 - only 蛋白家族。NIX 在网织红细胞分化为红细胞过程中，对线粒体的选择性清除起着关键作用；BNIP3 则在缺氧条件下与线粒体自噬相关。这两种情况下，线粒体自噬都由 BNIP3 或 NIX 转录水平的增加来调节，且这种调节具有高度的环境特异性。在缺氧条件下，这主要是因为缺氧诱导因子 - 1α（HIF - 1α）与冯?希佩尔 - 林道（VHL）Cullin 2 RING E3 连接酶底物适配器的相互作用被抑制，导致 HIF - 1α 水平升高。本文将重点关注新发现的对它们稳定性进行翻译后调控的机制。

BNIP3 和 NIX 的单跨 TM 结构域是甘氨酸拉链结构，这使得它们能够在膜内进行同源和异源二聚化。它们的大部分蛋白区域面向细胞质，其中包含一个非典型的 BH3 结构域和一个 LC3 相互作用区域（LIR）基序。LIR 基序能使它们与聚集在自噬体上的 LC3 及相关蛋白相互作用，但在网织红细胞成熟过程中，它并非线粒体自噬所必需。最近研究发现，一个短线性基序被确定为线粒体自噬的最小必需区域（MER），它能与 WIPI 家族的核心自噬蛋白结合。NIX 和 BNIP3 之间的冗余程度仍是研究热点，有趣的是，WIPI3 似乎只与 BNIP3 结合，而 NIX 和 BNIP3 都能与 WIPI2 结合。

FBXL4 在 NIX/BNIP3 依赖的线粒体自噬中的关键作用

2023 年发表的三篇论文都指出，Cullin 1（CUL1）RING E3 连接酶底物适配器 FBXL4 是无应激组织培养细胞中 NIX 和（或）BNIP3 依赖的线粒体自噬的核心成分。两项独立的研究分别利用基于 CRISPR 的筛选方法，通过定制的向导 RNA（gRNA）文库，基于荧光激活细胞分选（FACS）技术分离高线粒体自噬和低线粒体自噬细胞，一个文库包含约 600 个 E3 泛素连接酶，另一个包含约 1000 个注释的线粒体基因，这两项研究分别在 RPE1 和 HeLa 细胞中都指向 FBXL4 是线粒体自噬的关键抑制因子。另一项研究采用更具针对性的方法，先证明 Cullin E3 连接酶支架蛋白 CUL1 对不依赖 Parkin 的线粒体自噬有调节作用，然后利用 siRNA 介导的基因敲低技术测试选定的 CUL1 相关 F 盒蛋白，同样确定了 FBXL4 的重要性。

此前，FBXL4 是 SCF 泛素 E3 连接酶复合体（SCFFBXL4）中一个功能未知的底物适配器。现在已知 BNIP3 和 NIX 是其相关底物，上述研究均表明，缺失 FBXL4 会因 BNIP3 和 NIX 稳定性增加而导致它们的水平升高。而且，在 HeLa、U2OS 和 RPE1 细胞中，FBXL4 缺失后线粒体自噬的增加依赖于 NIX 和（或）BNIP3 的存在。对Fbxl4小鼠模型的分析显示，约 80% 的小鼠在出生后 3 天内死亡。出生当天（P0）小鼠的肌肉、心脏和肝脏组织中 BNIP3 和 NIX 水平显著升高，肺部仅 BNIP3 水平升高。对成年 Cas9 基因敲入小鼠肝脏感染携带荧光线粒体自噬报告基因（mtKeima）和靶向Fbxl4的 gRNA 的腺病毒双表达载体后，发现线粒体自噬增强。有趣的是，在 P0 Fbxl4小鼠大脑中未发现 BNIP3 或 NIX 水平升高。不过，有研究表明在小鼠神经母细胞和诱导多能干细胞分化为神经元的过程中，NIX 会被诱导表达，同时伴随着更高的线粒体自噬通量，且这一过程与向氧化磷酸化的转变在时间上相关。对携带 FBXL4 突变的患者来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化产生的神经元进行分析发现，这些神经元中 BNIP3 和 NIX 水平升高，且具有线粒体自噬增强的特征。

SCFFBXL4复合体的独特性质

人类基因组编码 69 种 F 盒蛋白，它们作为 SCF 泛素 E3 连接酶的特异性因子发挥作用。F 盒蛋白通过 SKP1 适配器与 CUL1 支架蛋白结合，SKP1 与 F 盒基序相互作用，另一个关键成分是 RING 指蛋白 RBX1，它能结合并激活 E2 结合酶。泛素连接酶的活性会因 CUL1 被小泛素样蛋白 NEDD8 修饰而显著增强。在 F 盒蛋白家族中，FBXL4 具有独特的结构特征，其 N 端有一个预测的跨膜结构域，后面跟着一簇带正电荷的残基，这使得它能够锚定在线粒体外膜上。AlphaFold 模型预测，该跨膜结构域之后是一个富含 β - 折叠的区域。与疾病相关的错义突变就发生在这个区域或 C 端富含亮氨酸的区域（LRR）。目前的实验表明，这些突变通过阻碍SCFFBXL4复合体的组装，而非影响对其生理底物 BNIP3 和 NIX 的识别，从而导致线粒体自噬水平升高。

PPTC7 的关键作用与调控机制

对蛋白磷酸酶靶向辅酶 Q7 羟化酶（Pptc7）基因敲除小鼠的分析发现，其表型与Fbxl4基因敲除小鼠相似，包括线粒体质量减少和 BNIP3 水平升高。在对 200 多个携带线粒体基因单基因缺失的 HAP1 细胞进行的蛋白质组学研究中，PPTC7 是导致 NIX 和 BNIP3 水平升高的最主要基因。此外，在基于细胞的 CRISPR 筛选中，PPTC7 与 FBXL4 一起被确定为不依赖 Parkin 的线粒体自噬的抑制因子。在 PPTC7 基因敲除细胞中进行的 CRISPR/Cas9 反向筛选确定 NIX 和 BNIP3 是其线粒体自噬指数升高的主要介导因子。

最初人们认为 PPTC7 的去磷酸化活性可能在其中发挥作用，因为已知 BNIP3 和 NIX 会被磷酸化，且磷酸化降解基序通常会被 F 盒蛋白识别。但实际情况更为复杂和出人意料。大规模亲和富集质谱分析显示，PPTC7 是 BNIP3 和 NIX 的独特相互作用蛋白，这一结果在后续多项研究中得到证实。酵母双杂交分析、从 FBXL4 基因敲除细胞中进行的 pulldown 实验以及使用纯化成分进行的重组实验都表明，PPTC7 与 BNIP3/NIX 的相互作用可能是直接的。然而，使用无法组装成功能性SCFFBXL4连接酶复合体且不受 PPTC7 基因敲除影响的 FBXL4 - △F - FLAG 构建体，可在细胞中重建 BNIP3/NIX 与 FBXL4 的独特相互作用。实际上，PPTC7 似乎调控着SCFFBXL4复合体的组装。PPTC7 基因敲除会减少 FBXL4 与 CUL1 的相互作用，而 PPTC7 过表达则会促进这种相互作用。进一步研究发现，PPTC7 能直接结合 CUL1 和 NIX，但它对 FBXL4 - CUL1 相互作用的稳定作用需要 NIX 的存在。因此，PPTC7 被认为是一个支架蛋白，它能形成一个具有更高亲和力的结合位点组合，促进全酶复合体的组装。AlphaFold 模型显示，PPTC7 就像一座桥梁，连接着 FBXL4 和 BNIP3/NIX，并将它们以一种最适合泛素化的构型呈现出来。这与辅助因子 CKS1 将 SKP2（FBXL1）与其底物细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 连接起来的作用类似。不过，要彻底阐明这些复杂的机制，还需要进一步的结构和定量生化研究。

PPTC7 基因敲除细胞中观察到的线粒体自噬升高现象，可通过敲除Bnip3和Nix基因来恢复，但仍会存在一些线粒体功能障碍，这可能与异常的磷酸化有关。在对 PPTC7 基因敲除系统进行的磷酸化蛋白质组定量分析中，虽然观察到 NIX 和 BNIP3 中磷酸化位点增加，但这些增加在归一化到总蛋白水平后并无显著差异。由于最明显的使 PPTC7 磷酸酶活性失活的突变会破坏其与 BNIP3/NIX 的相互作用，所以评估 PPTC7 磷酸酶活性的作用具有挑战性。在细胞中过表达 PPTC7 可以使 BNIP3 去磷酸化，但有两条证据表明，在基础条件下，这种活性并非线粒体自噬所必需。一是使用CdCl2?对磷酸酶进行相对粗略的抑制，并不影响 PPTC7 对线粒体自噬的抑制作用；二是通过结构建模设计出的磷酸酶活性受损但对复合体形成影响最小的突变体，仍具有介导 NIX 和 BNIP3 周转的能力。

PPTC7 的线粒体导入调控

PPTC7 被注释为线粒体基质蛋白，它含有一个由 13 个氨基酸组成的弱线粒体靶向序列。通过比较蛋白质免疫印迹的迁移模式发现，在缺乏 FBXL4 时，会出现一种迁移率稍高的 PPTC7 形式。蛋白酶保护实验表明，较低分子量的 PPTC7 形式会如预期般被隔离到线粒体基质中，而较高分子量的形式则会在线粒体表面积累。这种积累是由于 BNIP3/NIX 水平升高，它们与 PPTC7 的结合限制了 PPTC7 的导入及其向较低分子量基质形式的加工。这就形成了一种精妙的稳态控制模型：泛素 E3 连接酶的底物 BNIP3/NIX 将自身降解的限制因子 PPTC7 捕获并稳定在线粒体表面，在那里 PPTC7 可以组装SCFFBXL4全酶复合体。这就像是 BNIP3/NIX 与线粒体导入途径之间的一场 “拔河比赛”，目前还不清楚是否有因素或条件会打破这种平衡，但它与 PINK1 在导入应激时的积累现象存在相似之处。<