AcrVIB1 抑制 CRISPR-Cas13b 免疫机制的深度解析：从基础研究到应用展望

在细菌与噬菌体的 “军备竞赛” 中，CRISPR-Cas 系统与抗 CRISPR 蛋白（Acrs）的相互作用备受关注。研究人员针对仅有的 Cas13b 抑制蛋白 AcrVIB1 开展研究，发现其通过促进无生产性的 crRNA 结合并使其易受 RNase 攻击，抑制 CRISPR-Cas13b 免疫。这为理解噬菌体防御机制及 CRISPR 技术应用提供新视角。

　　在微生物的世界里，细菌与噬菌体之间展开着一场古老而持续的 “军备竞赛”。CRISPR-Cas 系统作为细菌的一种重要防御武器，能够利用 CRISPR RNA（crRNA）引导效应核酸酶识别并切割外来遗传物质，从而抵御噬菌体的入侵。然而，噬菌体也不甘示弱，进化出了抗 CRISPR 蛋白（Acrs）来抑制 CRISPR-Cas 系统的免疫防御。在众多 Acrs 中，大多数作用于 Cas 核酸酶 - crRNA 核糖核蛋白（RNP）复合物，但目前仅有少数作用于 RNP 复合物形成之前的机制被发现，且还有许多未知的抑制模式等待探索。

在这样的背景下，来自德国亥姆霍兹 RNA 感染研究所以及亥姆霍兹感染研究中心等机构的研究人员，针对 AcrVIB1 这一目前已知的唯一作用于 VI-B 型 CRISPR-Cas 系统中 Cas13b 核酸酶的抗 CRISPR 蛋白展开研究。他们发现，AcrVIB1 通过一种独特的机制抑制 CRISPR-Cas13b 的免疫功能，这一研究成果发表在《Molecular Cell》杂志上。

为了深入探究 AcrVIB1 的作用机制，研究人员运用了多种关键技术方法。在体外实验中，通过荧光标记的 RNA 底物进行 RNA 切割实验，监测荧光变化来评估 AcrVIB1 对 Cas13b 切割活性的影响；采用微尺度热泳（MST）技术测量蛋白质与 RNA 之间的结合亲和力；利用电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步验证结合情况。在体内实验方面，通过在大肠杆菌中异源表达相关蛋白和 RNA，运用蛋白质免疫印迹（western blotting）和 RNA 免疫印迹（northern blotting）技术检测蛋白质和 RNA 的丰度变化。此外，还借助冷冻电镜（cryo-EM）技术解析蛋白质 - RNA 复合物的结构，直观观察 AcrVIB1 对 Cas13b 结构的影响 。

研究结果如下：

• AcrVIB1 在体外抑制 Cas13b 的 RNA 切割活性：体外实验表明，AcrVIB1 在 RNP 复合物形成之前加入，对 Cas13b 的 RNA 切割活性抑制作用更强。研究人员通过体外切割实验，分别在加入 crRNA 前后添加 AcrVIB1，结果显示，在加入 crRNA 前添加 AcrVIB1 时，PbuCas13b 的附带 RNA 切割活性降低更为显著，这表明 AcrVIB1 主要在 RNP 复合物形成上游发挥抑制作用，同时它对靶 RNA 的切割也有抑制效果。
• AcrVIB1 在体内使 crRNA 不稳定但不影响 Cas13b：在大肠杆菌中进行的实验发现，AcrVIB1 与 PbuCas13b 共表达时，不影响 PbuCas13b 的表达和稳定性，但会导致 crRNA 水平显著下降。通过 western blotting 分析 PbuCas13b 水平，northern blotting 分析 crRNA 水平，结果表明 PbuCas13b 原本可保护 crRNA 不被降解，而 AcrVIB1 的存在逆转了这一保护作用。
• AcrVIB1 与 Cas13b 结合而非与 crRNA 结合：MST 测量显示，AcrVIB1 与 PbuCas13b 有紧密结合，解离常数（KD）为 44 nM，而与加工后的 crRNA - 1 未检测到结合。进一步实验发现，AcrVIB1 优先结合 PbuCas13b，而非 PbuCas13b:crRNA 复合物，这与它在 RNP 形成前发挥抑制作用的结论相符。
• AcrVIB1 促进 crRNA 与 PbuCas13b 的结合：与预期不同，MST 和 EMSA 实验均表明，AcrVIB1 存在时，crRNA 与 PbuCas13b 的结合显著增强，KD值从 1 mM 降至 160 nM。这说明 AcrVIB1 并非像其他一些 Acr 那样阻碍 crRNA 结合，而是促进其结合。
• 结合的 crRNA 未被加工且靶 RNA 结合改变：实验显示，AcrVIB1 与 Cas13b 结合后，阻止了 crRNA 的加工过程，即便有靶 RNA 存在，也无法激活附带 RNA 切割。同时，AcrVIB1 的存在使 PbuCas13b:crRNA - 1 RNP 复合物对靶 RNA 的结合亲和力降低，从KD值 85 nM 降至 153 nM，EMSA 实验中靶 RNA 的结合条带模式也发生改变，表明这种增强的结合是无生产性的。
• AcrVIB1 使 Cas13b 结合的 crRNA 易受 RNase 攻击：在体外实验中，研究人员将 crRNA - 1 在有或无 PbuCas13b 和 AcrVIB1 的情况下暴露于 RNase T1 或 RNase A 中。结果发现，PbuCas13b 可部分保护 crRNA 免受 RNase T1 的降解，但在 AcrVIB1 存在时，这种保护作用显著降低，说明 AcrVIB1 使结合的 crRNA 更易被 RNase 降解，从而解释了体内 crRNA 不稳定的现象。
• AcrVIB1 阻止 Cas13b 围绕 crRNA 闭合：cryo - EM 结构显示，没有 AcrVIB1 时，PbuCas13b 与 crRNA 形成的复合物结构紧凑；而加入 AcrVIB1 后，复合物变得异质且不紧凑，螺旋 - 2（Helical - 2）结构域与 HEPN - 1 和盖子结构域失去接触并发生摆动，导致 crRNA 完全暴露在溶剂中，这表明 AcrVIB1 对 Cas13b 的结构产生影响，阻碍其正常功能的发挥。
• AcrVIB1 结合 Cas13b 的 Helical - 2 结构域：通过 AlphaFold3 建模、尺寸排阻色谱 - 多角度光散射（SEC - MALS）和光谱位移滴定等实验验证，AcrVIB1 与 Cas13b 的 Helical - 2 结构域结合，形成 1:1 的复合物，解离常数为 251 nM。对预测结合界面的氨基酸进行突变实验，结果表明相关突变会影响 AcrVIB1 的抑制作用，进一步证实了两者的结合关系。

综合上述研究结果，研究人员提出了 AcrVIB1 的作用模型：在没有 AcrVIB1 时，Cas13b 正常结合并加工 pre - crRNA，随后识别靶 RNA 激活附带 RNA 切割；而在 AcrVIB1 存在的情况下，它通过与 Cas13b 的 Helical - 2 结构域紧密结合，使 Cas13b 处于开放构象，促进 pre - crRNA 的结合，但这种结合是无生产性的，既阻止了 pre - crRNA 的加工，又使结合的 crRNA 易受 RNase 攻击。即便靶 RNA 存在，AcrVIB1 结合的 Cas13b 也无法进行结构变化以激活附带 RNA 切割，从而有效地抑制了 CRISPR - Cas13b 的免疫功能。

这项研究具有重要意义。在基础研究方面，它揭示了 AcrVIB1 独特的抑制机制，为理解噬菌体如何克服细菌的 CRISPR - Cas 免疫防御提供了新的视角，丰富了人们对细菌 - 噬菌体相互作用的认识。同时，cryo - EM 分析还为 Cas13b 的 crRNA 加载步骤提供了结构信息，有助于进一步研究 Cas13b 的激活机制。在应用方面，AcrVIB1 的发现为控制基于 Cas13 的功能提供了潜在工具，虽然它不适用于依赖预形成 RNP 复合物的应用，但在转录后沉默等领域具有应用潜力，有望通过组织特异性表达来限制沉默作用于特定细胞类型，从而拓展和增强 CRISPR 技术的应用范围。不过，该研究也存在一些局限性，例如负责降解 crRNA 的 RNases 尚未明确，可能因宿主不同而有所差异；AcrVIB1 与 PbuCas13b 其他结构域的相互作用以及 Helical - 2 结构域运动与 CRISPR - Cas13b 功能之间的关系仍有待进一步研究；此外，该机制在其他 Cas13b 同源物中的适用性也需进一步探索 。尽管如此，这项研究依然为后续研究奠定了坚实的基础，推动了 CRISPR - Cas 系统和抗 CRISPR 蛋白领域的发展。