扫描探针显微镜：揭示生物分子凝聚物凝胶化与复性机制的有力工具

在生物分子凝聚物研究中，现有流变学方法存在局限，难以测量高弹性液滴及固体转变后的力学性质。研究人员利用扫描探针显微镜（SPM）对生物分子凝聚物进行研究，发现其能揭示凝聚物凝胶化和复性过程的流变转变，该成果有助于理解凝聚物行为和加速疗法开发。

　　在细胞的微观世界里，生物分子凝聚物正逐渐成为科研人员关注的焦点。这些凝聚物是由蛋白质、核酸或碳水化合物组成的无膜、相分离的密集液滴，它们在细胞内外或合成液体环境中发挥着多种重要功能，比如参与应激反应、转录调控和细胞信号传导等过程。然而，凝聚物也可能出现 “异常行为”，当它们发生固化时，会导致蛋白质异常聚集，进而引发如肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病。

目前，研究生物分子凝聚物流变学性质的方法存在诸多不足。光学镊子（OTs）虽然力分辨率高，但力范围有限，难以测量高弹性液滴和纤维形成后的力学性质，而且其高激光功率不适合研究热敏性生物分子，引入的珠子还可能干扰凝聚物的正常行为。微吸管抽吸法仅适用于牛顿流体特性的凝聚物，且在高频测量时存在惯性效应。荧光恢复后光漂白（FRAP）技术虽然能提供一些关于凝聚物流动性和扩散性的信息，但无法测量界面力学，在解释多组分液滴和静态凝聚物数据时也存在困难。

为了突破这些困境，来自荷兰莱顿大学医学系统生物物理学与生物工程系等机构的研究人员 Aida Naghilou、Oskar Armbruster 和 Alireza Mashaghi 开展了一项重要研究。他们利用扫描探针显微镜（SPM）对生物分子凝聚物进行深入研究，相关成果发表在《Cell Reports Physical Science》杂志上。

在这项研究中，研究人员主要采用了扫描探针显微镜（SPM）技术、荧光恢复后光漂白（FRAP）技术。研究人员使用 SPM 对生物分子凝聚物进行测量，在实验过程中，从相衬图像中选择凝聚物，让探针落在液滴上，以一定的预载力压入并在不同频率下调制压痕，通过记录 SPM 头的相对高度和悬臂偏转力随时间的变化数据，来分析凝聚物的力学性质。同时，他们使用 FRAP 技术测量凝聚物的扩散系数和黏度，用于与 SPM 测量结果进行对比验证。

研究结果主要包括以下几个方面：

1. 数据采集与分析：研究人员详细介绍了利用 SPM 测量凝聚物力学习性的数据采集过程。通过对测量数据进行一系列处理，包括移动平均滤波、数值求导等操作，精确确定了接触点和零压痕时间，从而准确反映凝聚物随时间的真实压痕情况。在此基础上，研究人员进一步计算出凝聚物的复杂频率相关流变行为，确定了其复数剪切模量、弹性模量（G′）和粘性模量（G′′）等重要参数。
2. pK-H 凝聚物性质：研究人员利用 SPM 技术研究了聚赖氨酸（pK）和肝素（H）形成的凝聚物（pK-H 凝聚物）在不同 KCl 浓度下的流变特性。研究发现，pK-H 凝聚物具有粘弹性，在所研究的浓度范围内，液滴在实验可达到的频率范围内表现出主导的粘性行为。随着 KCl 浓度的增加，凝聚物的黏度降低，这一趋势在 FRAP 实验中也得到了验证，即较高盐浓度下荧光恢复更快，扩散系数更大。此外，研究人员还发现，通过改变盐浓度可以诱导 pK-H 凝聚物发生凝胶化和复性过程。降低盐浓度（如将上清液稀释至 0.65M、0.5M KCl）可使凝聚物从主要的粘性向弹性转变，表现为形态上从液态、圆形转变为异质、刚性且边界不规则的液滴，力学性质上G′主导且G′和G′′表现出频率独立性；而增加盐浓度（如将 KCl 浓度从 0.5M 恢复到 0.65M、1M）则可使凝聚物恢复到液态，具有高粘性。这种复性过程在形态和力学性质上都有明显体现，且液滴对盐浓度变化几乎能瞬间响应。
3. 凝胶化与复性研究：研究人员不仅通过改变盐浓度诱导凝聚物凝胶化和复性，还利用加热去离子水增加测量腔湿度的方法，实现了原位、时间分辨的凝胶化研究。实验结果表明，缓慢吸附的湿度导致 KCl 浓度逐渐降低，使凝聚物的模量逐渐增加，最终获得类似凝胶的行为，具有主导的弹性性质。此外，研究人员还通过向 pK-H 液滴中添加化学交联剂甲醛（FA）来诱导凝胶化。实验发现，添加 FA 后，液滴的流变性质发生明显变化，从液态转变为凝胶态，这在 FRAP 实验中表现为几乎没有荧光恢复，而对照组添加水的液滴则显示出更快的荧光恢复。通过对比不同凝胶化机制（盐浓度变化和化学交联）诱导的凝胶化液滴的 SPM 测量结果，发现 0.5M KCl 下测量的液滴模量更高，这进一步证明了该方法在精确检测流变性质变化方面的通用性。

在研究结论与讨论部分，研究人员开发的 SPM - 基于的方法能够在压痕力作用下测量单个微滴的全范围流变性质，这对于理解凝聚物与膜的相互作用具有重要意义。该方法综合考虑了系统的多个方面，如补偿悬臂的流体动力学阻力、计算复杂系统弹簧常数等，相比以前的方法有了显著优化。虽然使用 SPM 研究生物分子凝聚物时存在一些需要考虑的因素，如悬臂刚度和非特异性相互作用，但研究人员通过改进接触点确定方法等措施，增强了测量的稳健性。此外，该方法能够研究可逆和不可逆凝胶化过程，对于检测病理性凝胶化和揭示药物对逆转凝胶化的效果具有重要价值，为研究与凝聚物相关的疾病提供了新的视角，有望推动药物研发领域的发展，帮助科研人员更好地理解疾病机制并开发出更有效的治疗方法。