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为解决细胞内运输研究中分子追踪受闪烁和光漂白限制、致病突变驱动蛋白对集体运输影响不明等问题，研究人员开展了模块化光稳定荧光 DNA 模块（FTOB）的研究。结果显示，FTOB 能有效观察突变驱动蛋白影响，该研究为剖析协同货物运输提供了新工具12。
在微观的细胞世界里，一场场忙碌而有序的 “运输大战” 时刻都在上演。细胞内的各种货物，就像城市中的物资，需要被精准地运输到指定地点，才能保证细胞的正常运转。而驱动蛋白（kinesin），则是这场运输大战中的 “运输工人”，它们承担着重要的运输任务。不过，当这些 “运输工人” 出现问题时，比如发生致病突变，就可能引发一系列的疾病，像肌萎缩侧索硬化症（ALS）、遗传性痉挛性截瘫等。
目前，在细胞内运输的研究领域，存在着不少挑战。一方面，传统的单分子检测技术在追踪分子运动时，常常受到荧光分子闪烁和光漂白的干扰，就像在大雾天气里追踪物体一样困难，难以精确地观察和分析运输过程中的细微变化。另一方面，虽然我们知道驱动蛋白的突变与多种疾病相关，但对于不同类型的驱动蛋白二聚体在同一货物上的协同作用机制，还知之甚少。为了深入了解这些问题，来自日本东北大学（Tohoku University）和三重大学（Mie University）的研究人员展开了一项意义重大的研究。他们的研究成果发表在《Cell Reports Physical Science》杂志上，为我们揭示了细胞内运输的神秘面纱。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是 DNA 纳米技术，通过精心设计合成荧光标记的微小 DNA 折纸模块（Fluorescence-labeled tiny DNA origami blocks，FTOB）；其次利用了 ALFA 标签 / 纳米抗体（ALFA-tag/nanobody）系统，实现 FTOB 与驱动蛋白的有效连接；最后借助全内反射荧光显微镜（TIRF microscopy），对分子运动进行高分辨率的观察3416。
下面让我们来详细了解一下研究结果：
- FTOB 的设计与特性：FTOB 被设计成含有六个荧光染料的四螺旋束结构，大小约 8.8nm。实验显示，它的荧光强度比单个 Cy3 染料标记的双链 DNA（1xCy3-dsDNA）高约四倍，光漂白前的寿命和首次闪烁时间分别是 1xCy3-dsDNA 的 11 倍和 43 倍，在氧气清除系统下光稳定性极佳。通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）和 TIRF 显微镜等技术验证了其正确组装和预期的荧光特性，且一对 5xCy3-FTOB 能有效作为分析分子马达集体运动的探针567。
- ALFA 标签和纳米抗体使 FTOB 与驱动蛋白有效结合：研究人员利用 ALFA 系统，将 FTOB 与驱动蛋白 KIF5C 成功结合。实验表明，FTOB 标记的 KIF5C 与单个染料标记的 KIF5C 在运动性上相似，且 5xCy3-FTOB 对可以有效连接两个不同的驱动蛋白，这说明 ALFA 系统和 FTOB 能够有效地桥接不同的驱动蛋白，为后续研究提供了有力的工具489。
- FTOB 追踪与疾病相关的突变驱动蛋白：研究人员引入 KIF5CE237K突变，通过 FTOB 观察发现，KIF5CE237K/KIF5CE237K同源二聚体在微管上固定不动，而 KIF5CWT/KIF5CE237K异源二聚体虽能运动，但速度明显低于 KIF5CWT/KIF5CWT同源二聚体，且在运动过程中频繁停顿，这表明 FTOB 能够有效剖析疾病相关突变驱动蛋白的运动特性101112。
- FTOB 对剖析突变驱动蛋白对集体运输的影响：研究人员用 5xCy3-FTOB 对将 KIF5CWT/KIF5CWT同源二聚体与 KIF5CE237K/KIF5CE237K同源二聚体或 KIF5CWT/KIF5CE237K异源二聚体进行偶联并观察其运动。结果发现，突变体二聚体显著阻碍了 KIF5CWT/KIF5CWT同源二聚体的运动，但在短时间内，复合物也会出现加速到与单个 KIF5CWT马达相似的速度，这表明突变马达会暂时脱离微管，使野生型马达能够顺利移动131415。
在研究结论和讨论部分，研究人员开发的 FTOB 具有诸多优势。相比之前的 FluoroCube，FTOB 制备更简单，结构更稳定。与传统的 DNA 折纸连接体相比，FTOB 在观察分子运动时，闪烁现象更少，能够捕捉到传统单染料难以观察到的罕见、短暂事件。通过对 KIF5C 突变体的研究，发现不仅 KIF5CE237K/KIF5CE237K同源二聚体，KIF5CWT/KIF5CE237K异源二聚体也会抑制野生型驱动蛋白的运输。此外，该研究还为进一步研究细胞内运输机制、不同类型驱动蛋白及其突变体之间的协同作用提供了有效的平台，有望帮助我们更好地理解相关疾病的发病机制，为未来开发针对性的治疗策略奠定基础。
