整合蛋白质组 - 转录组学：揭秘慢性肝病晚期纤维化的关键特征与诊疗新方向

推荐阅读：本文通过整合肝转录组学和血浆蛋白质组学，对 330 例个体进行研究（包括 40 例健康个体和 290 例不同病因的肝纤维化患者）。发现晚期纤维化相关的失调通路及 132 种循环蛋白，利用机器学习构建预测模型，为肝纤维化的发病机制研究和无创诊断提供新视角。

　　### 慢性肝病晚期纤维化的研究背景
慢性肝病（CLD）在全球范围内影响约 15 亿人，是重大的健康和经济负担。其主要病因包括慢性病毒性肝炎（CVH）、酒精性肝病（ARLD）和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。CLD 常伴随慢性肝损伤和持续炎症，进而发展为肝纤维化，严重时可进展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。肝纤维化的严重程度是影响长期发病率和死亡率的关键指标，但目前纤维化诊断往往在疾病晚期，这主要是由于其进展缓慢且常无症状，同时对潜在分子机制了解有限，缺乏有效的生物标志物。

肝纤维化是细胞外基质（ECM）蛋白过度积累的动态过程。尽管技术进步增进了对纤维化发生的理解，但受病因、合并症和生活方式等因素影响，在普通人群中识别晚期纤维化仍颇具挑战。早期诊断对于预防疾病进展至关重要，而系统生物学方法，如机器学习和生物网络分析，通过整合多组学数据，为研究纤维化机制提供了新途径。本研究利用肝转录组学和血浆蛋白质组学的多组学方法，全面分析从早期纤维化到肝硬化及相关 HCC 的患者，并验证血浆蛋白标志物，旨在为肝纤维化诊疗提供新依据。

研究方法

1. 研究对象：本研究为多中心研究，包含发现队列和验证队列，共 330 名成年参与者。发现队列有 40 名健康个体、144 例 CLD 患者和 34 例 CLD 合并 HCC 患者；验证队列有 68 例 CLD 患者和 44 例 CLD 合并 HCC 患者，且两队列在年龄和性别上匹配。研究详细记录了参与者的年龄、性别、临床参数和诊断等基线特征。
2. 样本采集与检测：采用 Kleiner 等人的系统评估 MASLD 患者的肝纤维化分期，用 METAVIR 评分系统评估 CVH 患者的肝纤维化分期。对发现队列中的 178 例肝组织样本进行 RNA 测序，分析肝转录组；运用 Olink Explore 1536 邻近延伸分析法检测 330 名参与者的 1463 种血浆蛋白。
3. 数据分析方法：运用多种 R 软件包进行数据分析。通过主成分分析（PCA）、均匀流形近似和投影（UMAP）等方法分析转录组和蛋白质组数据；使用 clusterProfiler 包进行基因集富集分析；采用 dampened weighted least squares（DWLS）算法进行单细胞反卷积分析；运用 Mfuzz 聚类分析血浆蛋白质组变化；构建随机森林（RF）和逻辑回归模型筛选生物标志物并评估模型性能。

研究结果

1. 转录组特征区分晚期纤维化：根据纤维化分期对肝转录组数据分组，UMAP 分析显示数据变化与纤维化严重程度相关，且不受性别、生活方式和合并症影响。基因集富集分析发现，晚期纤维化中 ECM 重塑、细胞 - 基质相互作用、免疫反应和炎症相关通路上调，代谢通路下调。转录因子富集分析表明，NF - κB1、REL、RELA 等转录因子在晚期纤维化中上调。差异基因表达分析鉴定出 93 个在 F3 期与 F0 - 2 期有差异表达的基因（DEGs），其中 97% 以上在肝硬化肝脏中也有显著差异，这些基因包括肝肌成纤维细胞、上皮 - 间质转化、活化门静脉成纤维细胞等相关标记基因。对不同病因的肝硬化样本分析发现，转录组谱在不同病因组间无明显差异，但 MASLD 与 CVH 相比，在核小体组装、染色质组织和重塑等生物过程中存在显著富集。
2. 单细胞反卷积揭示细胞组成异质性与纤维化评分的关联：通过单细胞反卷积分析 44 种细胞群体，发现 12 种细胞（亚）群体在纤维化相关组间丰度变化显著。肝硬化（F4 组）中，肝细胞、CD34^?CLEC4M⁺肝窦内皮细胞和自然杀伤细胞丰度显著降低，而瘢痕相关巨噬细胞（SAMs）和 PDGFRA⁺肌成纤维细胞比例增加。此外，两种 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞亚群在肝硬化肝脏中显著扩增，且这些细胞类型的丰度与纤维化评分呈正相关。
3. 肝病患者血浆蛋白质组变化反映疾病严重程度：UMAP 分析显示健康个体和患者的血浆蛋白质组谱明显分离，患者组内蛋白质组谱随纤维化进展逐渐变化。Mfuzz 聚类识别出三个蛋白质轨迹簇，分别与纤维化进展、伤口愈合和免疫反应相关。与健康对照相比，不同纤维化阶段患者的血浆蛋白水平有显著变化，554 种蛋白在所有患病组中均有差异，其中约 33% 与免疫反应相关。不同病因的肝硬化患者血浆蛋白谱比较发现，ARLD 与 MASLD 患者间无显著差异，ARLD 与 CVH 患者间有 24 种蛋白差异，MASLD 与 CVH 患者间血浆蛋白水平无显著差异。
4. 与晚期纤维化相关的蛋白质组 - 转录组特征：通过成对相关性分析，发现 498 种蛋白在晚期纤维化患者的肝基因表达水平和血浆丰度上均有显著差异，其中 132 种蛋白的丰度与肝平均 mRNA 表达强相关，被定义为蛋白质组 - 转录组特征。这些蛋白中部分为肝源性，且 47 种分泌到血液中，如 FGF21 和 FETUB。多数蛋白质组 - 转录组特征蛋白与 FIB - 4 呈正相关，与血浆白蛋白水平和血小板计数呈负相关。
5. 晚期纤维化和肝硬化的生物标志物面板：利用随机森林算法构建两个二元分类器，用于区分晚期纤维化（≥F3 模型）和肝硬化（肝硬化模型）患者。在发现队列中，两个模型预测晚期纤维化和肝硬化的受试者工作特征曲线下面积（AUROC）分别为 0.98（95% 置信区间 [CI] 0.97 - 1）和 0.99（95% CI 0.98 - 1）；在验证队列中，AUROC 分别为 0.88（0.80 - 0.96）和 0.89（95% CI 0.83 - 0.96）。逻辑回归分析显示，部分关键蛋白组合具有良好的预测能力，如 NFASC 和 GDF15 预测晚期纤维化的性能优于 FIB - 4。

研究讨论

本研究整合多种技术全面刻画了 CLD 患者的肝纤维化特征。转录组分析表明，晚期纤维化中 ECM 重塑、炎症和免疫反应相关通路的上调与以往研究一致。研究还发现，与 MASLD 相关的基因特征在不同病因的 CLD 纤维化进展中可能起重要作用，同时揭示了不同病因导致的转录组差异，特别是在病毒感染相关的肝硬化中宿主 - 病毒相互作用的关键作用。

单细胞反卷积分析进一步揭示了从早期纤维化到肝硬化过程中细胞群体的动态变化，包括 SAMs 的积累和免疫细胞的扩张，这有助于理解纤维化进展的病理生理过程。血浆蛋白质组分析显示，其变化与纤维化进展相关，且炎症和免疫反应相关蛋白失调，支持了全身炎症在肝纤维化发展中的重要作用。

机器学习模型结合生物标志物面板在预测晚期纤维化和肝硬化方面表现出较高的平衡准确率，优于传统临床标志物，为 CLD 患者晚期纤维化的早期诊断提供了新方向。然而，本研究存在一定局限性，如队列主要包含晚期纤维化和肝硬化患者，蛋白质组学检测可能未涵盖所有相关蛋白，生物标志物在普通人群中的适用性需进一步研究，且研究对象来自特定地区和种族，未来需扩大研究范围。

总之，本研究通过多组学方法揭示了 CLD 患者肝纤维化的转录功能障碍和细胞组成动态变化，确定的循环蛋白特征有助于理解肝纤维化的发病机制和早期诊断，为未来研究和临床应用奠定了基础。