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为解决番茄采后易变质、货架期短且现有延长货架期策略影响果实品质的问题，研究人员开展了番茄角质形成调控机制的研究。结果发现 SlGRAS9、SlZHD17 和 SlMBP3 转录因子协同与拮抗调控角质形成，为番茄育种提供新靶点。
番茄是全球重要蔬菜，营养丰富，既适合鲜食，也用于加工。但它在采后储存时极易快速变质，成熟阶段的番茄果实会极度软化，在运输和销售过程中易受病原体侵害和机械损伤。目前，将成熟突变位点导入商业品种是延长番茄货架期的常用方法，比如 ripening inhibitor（rin）、non-ripening（nor）和 never ripe（Nr）等，但这些策略会牺牲果实的感官品质，导致果实风味不佳。因此，如何在不影响番茄整体成熟过程的前提下，减少果实过度软化，提高采后储存性并保持果实品质，成为现代番茄育种面临的重大挑战。
在这样的背景下，重庆大学等研究机构的研究人员开展了相关研究。他们以番茄为研究对象，深入探究果实角质形成的调控机制。研究发现，SlGRAS9、SlZHD17 和 SlMBP3 这三个转录因子在番茄果实角质形成过程中发挥着重要作用，它们通过协同和拮抗模式调控角质形成，进而影响番茄果实的采后特性。这一研究成果发表在《Cell Reports》上，为番茄育种提供了新的靶点，有望通过调控这些转录因子来改善番茄果实的采后品质。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：利用 CRISPR-Cas9 技术构建基因敲除突变体，如 SlGRAS9 敲除株系（Slgras9-CR）；采用 RNA 干扰（RNAi）技术获得基因表达下调的植株，如 SlZHD17-RNAi 株系；通过 RNA 测序（RNA-seq）进行全基因组转录组分析，以挖掘差异表达基因；运用双荧光素酶报告基因检测（Dual-luciferase assays）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、萤火虫荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（coIP）等实验技术，研究转录因子之间的相互作用及对靶基因的调控机制。
研究结果如下：
- SlGRAS9 在果实外表皮高表达：研究人员通过挖掘番茄表达图谱（TEA）数据库，发现 SlGRAS9 在果实外表皮高表达，且其表达模式与角质积累相似。进一步的定量实时聚合酶链反应（real-time qPCR）检测表明，SlGRAS9 在果皮和外表皮组织中高表达，在破色后 3 天（Br+3）转录水平最高。
- SlGRAS9 功能缺失改变番茄果实角质形成：利用 CRISPR-Cas9 技术获得 SlGRAS9 敲除株系（Slgras9-CR），通过 RNAi 技术获得 SlGRAS9 表达下调株系（SlGRAS9-RNAi）。研究发现，Slgras9-CR 果实角质层沉积显著增加，角质层增厚，果实表面更不规则，角质化细胞壁增多，穿刺外果皮所需的力更大，角质单体含量也显著增加。RNA-seq 分析表明，SlGRAS9 功能缺失影响大量基因表达，其中 SlZHD17 和 SlMBP3 基因表达显著下调。
- SlZHD17 或 SlMBP3 下调影响番茄果实角质积累和沉积：RNAi 下调 SlZHD17（SlZHD17-RNAi）和 CRISPR-Cas9 敲除 SlMBP3（Slmbp3-CR）均导致果实成熟过程中角质层沉积增强，角质层增厚，表面粗糙，角质单体含量增加，穿刺外果皮所需的力更大。这表明 SlZHD17 和 SlMBP3 也参与番茄果实角质发育的调控。
- SlGRAS9、SlZHD17 和 SlMBP3 共同调控角质生物合成基因：RNA-seq 分析发现，SlGRAS9 和 SlZHD17 功能缺失的果实中，角质生物合成基因 SlCYP86A69、SlCYP77A1 和 SlGPAT6 表达上调。双荧光素酶报告基因检测和 EMSA 实验表明，SlZHD17 和 SlMBP3 可直接结合 SlCYP86A69 启动子并抑制其活性，而 SlGRAS9 不能直接结合该启动子。这说明 SlZHD17 和 SlMBP3 通过直接调控 SlCYP86A69 来调节角质单体生物合成。
- SlGRAS9 和 SlZHD17 对角质形成具有协同作用：在 SlGRAS9 缺陷株系中表达 SlZHD17 进行互补实验，结果显示，与未互补的突变体相比，互补株系果实角质层厚度降低，但仍高于野生型果实。这表明 SlZHD17 可部分恢复 SlGRAS9 缺陷果实的厚角质层表型，说明 SlGRAS9 和 SlZHD17 对角质形成具有协同作用，且可能存在其他独立于 SlZHD17 的因子调节角质形成。
- SlZDH17-SlMBP3 模块通过协同作用调节 SlCYP86A69 表达：双荧光素酶报告基因检测表明，SlGRAS9 可激活 SlMBP3 表达，但二者无相互作用。LCI 和 coIP 实验证明 SlMBP3 与 SlZHD17 可相互作用，且二者共同存在时对 SlCYP86A69 表达的抑制作用增强，说明 SlZHD17 和 SlMBP3 以协同方式调节 SlCYP86A69 表达。
- SlMIXTA-like 减轻 SlZHD17 或 SlMBP3 对 SlCYP86A69 启动子的抑制作用：LCI 和 coIP 实验表明，SlZHD17 和 SlMBP3 可与 SlMIXTA-like 蛋白相互作用。EMSA 实验显示，SlMIXTA-like 和 SlCD2 可剂量依赖性地抑制 SlZHD17 和 SlMBP3 与 SlCYP86A69 启动子的结合。双荧光素酶报告基因检测表明，SlMIXTA-like 和 SlCD2 可削弱 SlZHD17 和 SlMBP3 对 SlCYP86A69 启动子的抑制活性。这说明 SlMIXTA-like 和 SlCD2 与 SlZHD17 和 SlMBP3 在调节角质生物合成中起拮抗作用。
- SlGRAS9、SlZHD17 或 SlMBP3 表达受损增强果实采后储存期间对真菌腐烂的抗性：采后储存实验表明，敲除或下调 SlGRAS9、SlZHD17 或 SlMBP3 可延长果实货架期，降低果实对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）感染的敏感性，减少真菌繁殖。这表明果实角质层在提高番茄果实货架期和抵御病原体方面发挥重要作用。
研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了一个多组分模块调控番茄果实角质形成的机制，其中 SlCYP86A69 是关键的靶基因。多个转录因子通过协同和拮抗作用形成复杂的调控网络，精细调节角质生物合成代谢途径。这一研究为精准育种策略提供了新的靶点，有助于在不影响肉质果实风味品质的前提下，改善与角质相关的性状。此外，SlGRAS9、SlZHD17 和 SlMBP3 可能是连接表皮细胞模式形成和角质层发育的重要调节因子，它们的相互作用复合物可能参与果实发育的其他方面。然而，该研究也存在一定局限性，如难以获得多个基因突变的番茄株系，且这些转录因子在其他园艺物种中的功能保守性有待进一步研究。总体而言，该研究为深入理解番茄果实角质形成调控机制提供了重要依据，对番茄及其他园艺作物的分子育种具有重要指导意义。
