弓形虫出胞与胞内发育的磷酸化中继反馈回路调控机制及其医学意义

《Phospho-relay feedback loops control egress vs. intracellular development in Toxoplasma gondii》一文揭示了弓形虫（Toxoplasma gondii）胞内发育与出胞过程的调控机制。蛋白激酶 Ac1（PKAc1）抑制出胞，腺苷酸环化酶 ACα3 等调节 PKAc1，其与磷酸二酯酶 2（PDE2）形成负反馈回路。该研究对理解弓形虫感染机制意义重大。

　　### 研究背景
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种能感染多种温血动物几乎所有有核细胞的专性胞内寄生虫，在全球范围内引发人畜疾病。其感染宿主细胞后，会经历从活跃运动、入侵到在胞内静止复制，再到激活运动并出胞继续裂解循环的过程。在急性感染期，多次裂解循环导致寄生虫扩散。然而，弓形虫如何协调活跃的蛋白分泌、运动与静止的胞内复制之间的转换，目前尚不清楚。

此前研究表明，弓形虫速殖子的活跃运动、入侵和出胞受蛋白激酶 G（PKG）通路调控，该通路与钙浓度升高及钙依赖蛋白激酶（CDPKs）激活协同作用。这一信号级联由膜相关鸟苷酸环化酶（GC）启动，GC 产生环磷酸鸟苷（cGMP）激活 PKG。PKG 刺激细胞内钙库释放钙，并可能促进细胞外钙的摄取。在相关的疟原虫中，钙反应、CDPKs 和运动蛋白都是 PKG 的下游靶点。在弓形虫中，使用磷酸二酯酶（PDE）抑制剂扎普司特处理钙报告菌株，也表明 PKG 参与控制钙释放。此外，该通路还依赖一种名为储存增强和激活激酶（SPARK）的 AGC 激酶，其对 PKG 依赖的细胞内钙释放至关重要。升高的钙可激活 CDPK1 和 CDPK2A，调节微线体分泌和黏附素的部署。研究还发现，CDPK1、CDPK3 和 PKG 通过正反馈回路相互作用，促进钙依赖的蛋白分泌和运动，这对弓形虫入侵和离开宿主细胞至关重要。

弓形虫含有三种蛋白激酶 A（PKA）同工型，先前研究显示 PKAc3 参与负调节缓殖子分化，PKAc2 主要在猫肠道的裂殖生殖过程中表达。相比之下，PKAc1 被认为是 PKG 通路的负调节因子。不过，此前研究未揭示 PKAc1 的调控机制、激活因素及最终关闭方式。此外，虽然已确定 PDE2 是 PKAc1 的潜在底物，但二者之间的相互作用及对弓形虫发育的影响尚待研究。

实验方法

1. 质粒构建：利用多种工具和试剂盒构建用于研究的质粒，包括引入同源侧翼序列、进行定点突变、使用 HiFi DNA 组装试剂盒等，构建完成后进行转化、筛选和测序验证。
2. 转基因寄生虫的制备：通过转染 Tir1 - 3FLAG 寄生虫，使用特定的转染试剂和条件，制备多种转基因寄生虫株，如用于条件性调控 PKAc1、PDE2 的寄生虫株，以及用于监测钙信号的寄生虫株等，并通过 PCR、免疫荧光分析（IFA）和蛋白质免疫印迹（Western blot）等方法进行验证。
3. 蛋白质分析方法：包括 Western blotting 用于检测蛋白表达水平，IF microscopy 用于观察蛋白定位，Plaque formation assay 评估寄生虫的裂解生长能力，Purification of recombinant PDE2（rPDE2）获取重组 PDE2 蛋白，PDE assays 测定 PDE2 的活性，cAMP 和 cGMP ELISA assays 检测细胞内 cAMP 和 cGMP 的水平，PhosTag gels 分析 PDE2 的磷酸化状态，Identification of PDE2 phosphosites 通过质谱鉴定 PDE2 的磷酸化位点，Egress assays 检测寄生虫的出胞情况。
4. 统计分析：使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，采用 Student’s t - tests 检验，当 p 值小于 0.05 时认为差异具有统计学意义。

实验结果

1. PKAc1 条件性降解激活提前出胞：利用 mini auxin - inducible degron（mAID）系统，给 PKAc1 的 C 末端添加 mAID - 3HA 标签，发现添加生长素（IAA）可促进 PKAc1 - mAID - 3HA 的高效降解。PKAc1 - mAID - 3HA 定位于寄生虫外周，其降解导致寄生虫裂解生长缺陷。进一步研究发现，PKAc1 缺失的寄生虫虽能有效入侵细胞，但 64% 会在 15 分钟内出胞，而表达 PKAc1 的寄生虫入侵后 100% 留在细胞内。同时，PKAc1 缺失的寄生虫钙水平持续振荡，而正常寄生虫入侵后钙水平受到抑制。此外，敲低 PKAc1 在感染后期不会诱导出胞，表明其在早期感染中至关重要，后期则非必需。
2. ACs 在控制 PKAc1 中的作用：重新审视弓形虫基因组，鉴定出三种腺苷酸环化酶（AC）同工型 ACα1、ACα2 和 ACα3。这些 AC 含有独特的结构域，包括 N 末端电压门控 K 通道、HAMP 结构域、AC 结构域和 TPR 结构域。通过 CRISPR - Cas9 基因编辑删除各基因，发现 ACα3 基因敲除的寄生虫形成的噬斑数量与野生型相似，但显著更小，且其提前出胞率显著升高。这表明 ACα3 主要负责产生 cAMP 并激活 PKAc1。
3. PDE2 对出胞的调控及对 PKAc1 的负调节作用：为研究 PDE2 的作用，给 PDE2 的 C 末端添加 mAID - 3HA 标签。结果显示，IAA 处理可使 PDE2 - mAID - 3HA 迅速高效降解，其定位于胞质内的点状结构。PDE2 缺失的寄生虫虽能形成噬斑，但平均大小显著减小，且自然出胞延迟。PDE2 是 cAMP 特异性 PDE，其缺失导致 cAMP 水平升高，cGMP 水平略有下降。同时，PKAc1 缺失也会导致 cAMP 水平升高，这暗示 PKAc1 与 PDE2 之间可能存在反馈回路。
4. PKAc1 对 PDE2 的磷酸化作用：在大肠杆菌中共同表达 PDE2 的催化结构域（PDE2_CAT）与活性 PKAc1 或无活性的 PKAc1（K65H 点突变），通过 Phos - tag gels 检测发现，与活性 PKAc1 共表达时，PDE2_CAT出现多条迁移带，表明存在多个磷酸化位点；经 λ 磷酸酶处理或与无活性 PKAc1 共表达时，迁移带变为单一快速迁移带。通过质谱鉴定出 PDE2_CAT上的 17 个磷酸化位点，其中 S1820、S1819、S1790、S1799 和 S1995 等位点富集度较高。在弓形虫体内实验中，也鉴定出多个受 PKAc1 调控的磷酸化位点，这些位点主要集中在 N 端和 C 端催化结构域。根据位置将磷酸化位点分为三组，序列分析发现 PKAc1 对 PDE2 的磷酸化基序为 RXXS/TP。
5. PDE2 磷酸化突变对酶活性和寄生虫出胞的影响：通过构建磷酸化模拟或消除突变的 PDE2，在 HEK293T 细胞中表达并纯化后检测其对 cAMP 的水解活性。结果表明，野生型 rPDE2 具有 cAMP 水解活性，催化位点突变（H1994A 和 D1945A）使活性丧失。N 端第 1 组位点的磷酸化消除突变（S/A）降低了 PDE 活性，而磷酸化模拟突变（S>D）则增强了活性。将这些突变体在寄生虫中表达，发现催化活性丧失的突变体无法恢复出胞，而磷酸化模拟突变体可恢复出胞，磷酸化消除突变体则显著降低出胞率，表明第 1 组位点的磷酸化对 PDE2 的完全活性至关重要，其可降解 cAMP，抑制 PKAc1，从而促进出胞。
6. PKAc1 抑制出胞的作用靶点：敲低 PDE2 - mAID - 3HA 后，用扎普司特或离子霉素刺激寄生虫出胞和钙信号。结果显示，PDE2 缺失的寄生虫出胞显著减少，钙信号受到抑制；而用离子霉素处理可使钙水平升高并恢复出胞。使用 PKA 抑制剂 H89 处理 PDE2 缺失的寄生虫，可部分恢复出胞和钙信号。这表明 PKAc1 通过作用于 cGMP 产生下游和钙释放上游的过程来抑制出胞。

研究结论

本研究利用生长素诱导的降解系统，明确了 PKAc1 在抑制 PKG 和钙依赖运动方面的时间作用，其在入侵后迅速抑制 PKG 通路，促进胞内静止发育。PKAc1 对 PDE2 的关键 N 端残基进行磷酸化，激活其水解 cAMP 的活性，PDE2 通过消耗 cAMP 下调 PKAc1，形成负反馈回路。PDE2 缺失会损害自然出胞和扎普司特刺激的出胞，而离子霉素刺激可克服这种阻断，表明 PKAc1 调节出胞通路的关键底物位于 GC 和钙释放之间。综合此前研究，提出了弓形虫速殖子裂解周期的调控模型：入侵前，PKG 通路活跃，支持运动和入侵；入侵后，ACα3 等产生 cAMP 激活 PKAc1，PKAc1 关闭 PKG 通路，防止提前出胞，并磷酸化激活 PDE2，消耗 cAMP 使 PKAc1 失活；感染后期，PKG 通路再次激活，可能是由于磷酸酶去除抑制性磷酸化或蛋白质周转等原因。本研究揭示的正负反馈回路相互作用，使寄生虫能够根据环境信号灵活调节运动和胞内生长，为深入理解弓形虫感染机制提供了重要依据。

研究展望

虽然本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，PDE2 N 端磷酸化如何影响其催化结构域的活性尚不清楚，需要进一步研究。此外，对 PKAc1 在入侵后对 PKG 通路靶点的磷酸化动态变化，以及其底物特异性的更精确界定，也有待后续研究。未来可通过时间依赖性分析和合成肽阵列等方法，深入探究这些问题，为开发针对弓形虫感染的新型治疗策略提供更坚实的理论基础。