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为探究 HIF1α-CTCF 轴介导缺氧下上皮 - 间质转化（EMT）的机制，研究人员开展了缺氧诱导 CTCF 促进乳腺癌 EMT 机制的研究。结果发现缺氧驱动 CTCF 重新分布，调控 COL5A1 表达和可变剪接促进 EMT，这为乳腺癌治疗提供了新靶点。
在肿瘤的发展进程中，乳腺癌如同一个隐匿在黑暗中的 “杀手”，严重威胁着人类的健康。其导致死亡的主要原因并非原发肿瘤本身，而是癌细胞的转移，就像癌细胞学会了 “迁徙”，从原发部位扩散到身体其他地方，在新的 “领地” 扎根生长，进而引发一系列难以控制的严重后果。
肿瘤缺氧（tumor hypoxia），作为实体肿瘤微环境中的一个关键因素，宛如癌细胞转移的 “幕后推手”。它能激活缺氧信号，赋予肿瘤细胞更强的可塑性，推动上皮 - 间质转化（EMT）的发生。这一转化过程就像是癌细胞经历了一场 “变形记”，上皮细胞原本具有规则的形态和紧密的连接，而经过 EMT 后，它们变得更具侵袭性，获得了间质细胞的特性，从而为癌细胞的转移打开了大门。
在之前的研究中，人们发现缺氧可通过缺氧诱导因子 1α（HIF1α）诱导 CCCTC 结合因子（CTCF）的表达，并且 HIF1α - CTCF 轴对乳腺癌细胞的侵袭性有促进作用。然而，HIF1α - CTCF 轴在缺氧条件下介导 EMT 的具体机制，却如同被迷雾笼罩，始终未被清晰地揭示。这一知识空白，使得我们在对抗乳腺癌转移的道路上举步维艰。因此，深入探究 CTCF 在缺氧环境下调控其靶基因以促进 EMT 的机制，就显得尤为迫切和重要。
为了揭开这层神秘的面纱，印度科学教育与研究学院博帕尔分校（Indian Institute of Science Education and Research Bhopal）的研究人员展开了深入的研究。他们通过一系列严谨而复杂的实验，最终得出了一系列令人瞩目的结论，为我们理解乳腺癌转移机制和寻找潜在治疗靶点提供了新的视角和方向。该研究成果发表在《Cell Reports》杂志上。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在分析基因表达和 DNA - 蛋白质相互作用方面，采用了切割释放并使用核酸酶的检测（CUT&RUN）和染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）技术，以探究 CTCF 在基因组上的结合位点变化。利用 RNA 测序（RNA - seq）分析基因表达情况。通过甲基化 DNA 免疫沉淀定量 PCR（MeDIP - qPCR）检测 DNA 甲基化水平。为研究染色质构象，运用了染色体构象捕获（3C）和环形染色体构象捕获测序（4C - seq）技术。此外，还使用了 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑，以验证相关基因和信号通路的功能。研究中使用了多种细胞系，如 MCF7 和 HCC1806 等作为样本队列。
下面来详细看看研究结果：
- 缺氧获得的 CTCF 结合与 EMT 相关基因的关系：研究人员发现，缺氧条件下乳腺癌细胞中 CTCF 表达上调。通过 CUT&RUN 和 ChIP - seq 分析，发现缺氧导致 CTCF 结合位点发生显著重分布，有 2156 个位点获得结合，973 个位点失去结合。进一步研究发现，193 个缺氧诱导基因与缺氧获得的 CTCF 位点相关，基因本体分析显示这些基因与缺氧、TNFα 信号通路和 EMT 等相关。通过对乳腺癌 TCGA 数据集的分析，发现高表达这 193 个 CTCF 相关缺氧基因的样本中，多个 EMT 相关数据集显著富集，其中 COL5A1 在富集分数中表现突出，且缺氧时 COL5A1 启动子附近 CTCF 结合增加。
- CTCF 促进缺氧诱导的 EMT 基因 COL5A1 的表达：临床数据显示，乳腺癌肿瘤样本中 COL5A1 表达高于正常样本，且缺氧高表达组的 COL5A1 水平显著高于缺氧低表达组。在 MCF7 和 HCC1806 细胞系中，缺氧条件下 COL5A1 的 mRNA 和蛋白质水平均增加。对 COL5A1 启动子分析发现，其含有缺氧反应元件（HRE）和 CTCF 结合位点，且缺氧时该区域 DNA 甲基化水平降低，HIF1α 和 CTCF 的富集增加。通过实验证明，HRE 和 CTCF 基序对 COL5A1 在缺氧条件下的激活至关重要，且 CTCF 对 COL5A1 表达的影响比 HIF1α 更大。
- 缺氧驱动 COL5A1 的可变剪接事件并促进外显子 64A 的包含：研究发现，缺氧可促进乳腺癌细胞中 COL5A1 基因外显子 64 的可变剪接，且更倾向于包含外显子 64A。分析发现，缺氧时外显子 64A 的 CTCF 结合增加，DNA 甲基化水平降低，RNA Pol II 在该外显子上的暂停增加。CTCF 或 HIF1α 的缺失会导致外显子 64A 的包含减少，外显子 64B 的包含增加，表明 COL5A1 外显子 64A 的包含受缺氧驱动、DNA 甲基化依赖的 CTCF 介导的 RNA Pol II 暂停调控。
- 缺氧驱动、CTCF 介导的 COL5A1 外显子 64A 包含促进乳腺癌细胞的 EMT：破坏外显子 64A 下游的 CTCF 基序会减少 CTCF 和 RNA Pol II 在外显子 64A 上的结合，降低外显子 64A 的包含，增加外显子 64B 的包含。过表达 COL5A1 外显子 64A 可增加缺氧细胞的侵袭和迁移能力，而 COL5A1 外显子 64B 则无此作用，且会促进细胞增殖。在 CTCF 缺失的细胞中，恢复 COL5A1 外显子 64A 的表达可逆转侵袭抑制作用，表明 CTCF 介导的 COL5A1 外显子 64A 包含促进缺氧条件下的 EMT。
- 靶向甲基化 CTCF 结合位点改变 COL5A1 外显子 64 的可变剪接：利用 dCas9 - DNMT3A 系统靶向 COL5A1 外显子 64A 附近的 CTCF 结合位点，发现可导致外显子 64 的可变剪接发生改变，减少外显子 64A 的包含，增加外显子 64B 的包含。同时，细胞的侵袭能力降低，增殖能力增强，表明缺氧介导的 DNA 去甲基化和 CTCF 介导的 RNA Pol II 暂停足以驱动 COL5A1 外显子 64 的可变剪接，促进外显子 64A 的包含和 EMT 表型。
- CTCF 介导的启动子 - 外显子上游环化调节 RNA Pol II 暂停和外显子 64A 的包含：通过 4C - seq 和 3C - qPCR 分析发现，缺氧时 COL5A1 启动子与外显子 64A 上游的 T1 位点发生特异性相互作用，且这种相互作用依赖于 CTCF。靶向 T1 位点的 CTCF 结合位点进行甲基化，会减少启动子与 T1 位点的相互作用，降低 CTCF 介导的 RNA Pol II 在外显子 64A 上的暂停和外显子 64A 的包含，表明 CTCF 介导的启动子 - 外显子上游环化通过调节 DNA 甲基化和 RNA Pol II 暂停来调控外显子 64A 的包含。
- 缺氧驱动的 CTCF 差异结合调控转录和可变剪接重编程：CTCF - ChIP - seq 分析发现，缺氧条件下有 4142 个 CTCF 结合位点显著增加，这些位点与 2515 个基因的启动子重叠，相关基因富集在 mTORC1、β - catenin 和 TNFα 相关通路。进一步分析发现，缺氧条件下有 18826 个外显子包含事件，其中 1257 个与 CTCF 介导的可变剪接相关，涉及 1137 个蛋白质编码基因。对 AOPEP 基因的验证也支持了研究提出的模型，表明 CTCF 在缺氧条件下调控转录和可变剪接，促进乳腺癌细胞的 EMT。
研究结论和讨论部分表明，本研究揭示了缺氧 - CTCF 轴在调控 EMT 基因表达和可变剪接方面的重要作用。缺氧诱导 CTCF 在 COL5A1 启动子上富集，促进其表达，且 HIF1α 的结合依赖于 CTCF。同时，缺氧驱动的 CTCF 结合调控 COL5A1 外显子 64 的可变剪接，通过 DNA 去甲基化、CTCF 介导的 RNA Pol II 暂停和启动子 - 外显子上游环化等机制，促进外显子 64A 的包含，进而促进 EMT。研究还发现，靶向破坏 HIF1α - CTCF - COL5A1 外显子 64A 轴可减轻缺氧癌细胞的 EMT，为乳腺癌治疗提供了潜在的新靶点。然而，研究也存在一定的局限性，如 CTCF 介导的启动子 - 外显子上游环影响下游可变剪接外显子的表观遗传重编程的具体分子机制仍有待进一步研究，CTCF 介导的全局染色质环化对可变剪接的调控以及缺氧诱导的 CTCF 重分布对基因组结构的影响也需要更多的探索。但总体而言，该研究为理解乳腺癌转移机制和开发新的治疗策略提供了重要的理论基础和研究方向。
