揭秘 USP9X：调控中枢神经系统血管发育与屏障维持的关键 “开关”

为探究去泛素化酶在中枢神经系统（CNS）血管化和屏障功能中的作用，研究人员开展了关于泛素特异性肽酶 9 X 连锁（USP9X）对 CNS 血管形成和屏障维持影响的研究。结果发现 USP9X 通过调节 Wnt 信号通路起关键作用，这为 CNS 血管疾病研究提供了新方向。

　　在人体这个神奇的 “小宇宙” 里，中枢神经系统（CNS）如同精密的 “指挥中心”，掌控着身体的各项机能。而中枢神经系统中的血管，就像一条条纵横交错的 “交通要道”，不仅为神经细胞输送着养分，还构建起了血脑屏障（BBB）和血视网膜屏障（BRB），守护着 “指挥中心” 的安全，防止有害物质入侵。

然而，在一些常见的中枢神经系统疾病，如中风、糖尿病视网膜病变（DR）等病症发生时，这些重要的 “交通要道” 和坚固的 “屏障” 会遭到破坏。这不仅会导致神经细胞的营养供应出现问题，还会让有害物质趁机而入，进一步加重病情。因此，深入了解维持中枢神经系统屏障完整性的信号机制，对开发治疗相关疾病的策略至关重要。

为了揭开这个谜团，天津医科大学的研究人员展开了深入研究。他们聚焦于泛素特异性肽酶 9 X 连锁（USP9X），探究其在中枢神经系统血管形成和屏障维持中的作用。最终发现，USP9X 是调控 Wnt 信号通路的关键去泛素化酶，它能通过稳定 β-catenin，对中枢神经系统血管化和屏障功能起到至关重要的调控作用。这一成果发表在《Developmental Cell》杂志上，为中枢神经系统血管疾病的研究开辟了新的方向，有望为相关疾病的治疗带来新的曙光。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在细胞和分子层面，通过构建相关小鼠模型，如内皮特异性 Usp9x 基因敲除小鼠，来观察基因变化对表型的影响；利用 RNA 干扰（RNAi）技术，敲低 USP9X 的表达，探究其功能；借助免疫沉淀和免疫印迹技术，分析蛋白质之间的相互作用和表达水平。在样本获取方面，使用了多种细胞系，如人脑血管微血管内皮细胞（HCMECs）等，以及小鼠胚胎、脑组织和视网膜组织等样本进行实验。

下面来具体看看研究的主要结果：

• Genomics screening identified USP9X as a key regulator of Wnt-signaling activity in BECs：研究人员构建了基于腺病毒的 TOP-Flash 报告基因，利用人 DUB 特异性小干扰 RNA（siRNA）文库对 98 个去泛素化酶（DUBs）进行基因组筛选，发现 USP9X 是脑血管内皮细胞（BECs）中 Wnt 信号活性的关键调节因子。通过免疫沉淀和共免疫沉淀实验，确定 β-catenin 是 USP9X 在调节 Wnt 信号中的底物，二者通过特定结构域相互作用。
• USP9X regulates β -catenin stability by modulating K48-dependent ubiquitination in BECs：研究发现，敲低 USP9X 或用 DUB 抑制剂 WP1130 处理，会降低 β-catenin 蛋白水平，且该过程依赖蛋白酶体。CHX chase 实验表明，USP9X 敲低会缩短 β-catenin 半衰期，而过表达 USP9X 则增加其稳定性。进一步研究发现，USP9X 主要催化 β-catenin 上的 K48 连接的泛素链，从而调节其稳定性。
• USP9X regulates Wnt-signaling activity in CNS vasculature：通过单细胞 RNA 测序（sc-RNA-seq）分析发现，Usp9x 在小鼠大脑发育各阶段的 BECs 中均有表达。在体内实验中，利用基因敲除小鼠模型，发现内皮细胞中 Usp9x 缺失会降低 Wnt 信号活性，影响大脑血管覆盖。RNA 测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）也证实了 USP9X 对 Wnt 信号通路的调节作用。此外，USP9X 敲低会显著降低多种 Wnt 配体诱导的 TOP-Flash 转录活性。
• USP9X regulates CNS vascular morphogenesis via Wnt signaling：以小鼠视网膜为模型研究发现，内皮细胞中 Usp9x 缺失会导致视网膜血管化缺陷，包括血管面积、分支、径向生长和 sprouts 数量减少，且这种缺陷在成年后仍存在。通过 LiCl 和 Ctnnb1^flex3/+小鼠进行的拯救实验表明，这些血管缺陷依赖 Wnt 信号通路。
• USP9X is required for BBB and BRB formation and is mediated by Wnt signaling：研究表明，USP9X 在血脑屏障（BBB）和血视网膜屏障（BRB）形成中不可或缺。在胚胎期，Usp9x^ΔEC(Tie2)胚胎的 BBB 存在渗漏，出生后，Usp9x^iΔEC(pdgrb)小鼠的 BBB 和 BRB 也出现功能障碍。Wnt 信号通路靶基因在 Usp9x^iΔEC(pdgrb)小鼠大脑中下调，而在 Usp9x^iΔEC(pdgrb);Ctnnb1^flex3/+小鼠中得到拯救，证明了该过程对 Wnt 信号的依赖性。
• USP9X maintains BBB and BRB integrity in adulthood：在成年小鼠中，诱导 Usp9x 基因缺失会导致 BBB 完整性受损，表现为 FITC - 葡聚糖渗漏增加，claudin-5 表达降低，PLVAP 表达增加。而全身敲除 Usp9x 后，未观察到明显的神经缺陷，这为成年期进行药物抑制研究提供了可行性。
• USP9X is essential for BBB and BRB integrity in pathological conditions：在脑出血（ICH）和氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中，Usp9x 缺失会加重 BBB 和 BRB 的破坏。在 ICH 模型中，Usp9x^iΔEC(pdgrb)小鼠脑内出血面积增大，神经功能缺损加剧；在 OIR 模型中，Usp9x^iΔEC(pdgrb)小鼠病理性新生血管形成增加。表达激活形式的 β-catenin 可部分拯救这些缺陷。
• TGF-β signaling controls USP9X-β -catenin axis in BECs：研究发现，TGF-β 信号通路可通过磷酸化 USP9X，增强其与 β-catenin 的结合，促进 β-catenin 核转位。但 USP9X 似乎不调节 TGF-β -Smad4 和 Notch 通路。

综上所述，该研究首次揭示了 USP9X 在调节中枢神经系统血管化和屏障维持中的重要作用。这一发现不仅加深了人们对中枢神经系统血管发育和疾病发生机制的理解，还为中枢神经系统血管疾病的治疗提供了潜在的新靶点。未来，有望基于这些发现开发出更有效的治疗策略，为相关患者带来新的希望。然而，研究也存在一定局限性，如在 Wnt3a 诱导的 TOP-Flash 活性筛选中，其他 DUBs 对 Wnt 信号的影响机制尚未明确，仍需进一步研究。