COMET 技术：大规模解析 E3 泛素连接酶与底物互作关系的创新突破

在细胞内，E3 泛素连接酶（E3s）虽对蛋白质降解特异性起关键作用，但超 600 种人类 E3s 中多数底物未知。为解决该问题，研究人员开展 COMET（combinatorial mapping of E3 targets）研究，筛选出众多 E3 - 底物关系，还利用深度学习评估模型。这为理解蛋白降解调控网络提供关键数据 。

　　细胞如同一个精密运转的微型工厂，蛋白质则是其中忙碌的 “工人”。这些 “工人” 的数量和活性必须受到精准调控，细胞才能正常运作。在这个调控过程中，E3 泛素连接酶（E3s）扮演着至关重要的角色，它通过给底物蛋白加上泛素标签，标记这些蛋白进行降解，从而控制细胞内蛋白质的水平。然而，目前已知的人类 E3s 超过 600 种，绝大多数 E3s 的底物却依然是个谜。这种信息的缺失，就像在工厂中不知道哪些 “指令员” 负责管理哪些 “工人”，严重阻碍了我们对细胞蛋白质调控机制的深入理解，也限制了相关疾病治疗靶点的开发。

为了填补这一知识空白，来自美国华盛顿大学（University of Washington）的研究人员开展了一项具有开创性的研究。他们开发了一种名为 COMET（combinatorial mapping of E3 targets）的技术框架，旨在大规模地识别 E3s 与底物之间的相互作用关系。这项研究成果发表在《Molecular Cell》杂志上，为该领域带来了新的曙光。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先是 CRISPR 技术，通过设计针对 E3s 的 gRNA，实现对 E3s 基因的精准扰动；其次是构建包含大量 E3s 和潜在底物组合的文库，将其导入细胞进行筛选；最后利用 AlphaFold-Multimer 进行计算建模，从结构层面评估 E3 - 底物相互作用的可能性。

下面来具体看看研究结果：

1. 一种检测 E3 连接酶靶底物的组合筛选方法：研究人员设计了一种受 GPS 启发的双荧光报告系统，构建了 COMET 质粒文库，每个质粒代表一个潜在的 E3 - 底物相互作用对。将文库整合到表达 rtTA 和 Cas9 的细胞系（如 HEK293-rtTA-Cas9 和 K562-rtTA-Cas9）中，利用荧光激活细胞分选（FACS）根据 GFP:mCherry 比例对细胞进行分选，再通过扩增子测序量化 gRNA-ORF 对，实现了对 E3 - 底物对的高通量筛选。
2. 将 COMET 应用于 F-box 蛋白和 SCF 连接的底物：以 SCF 复合物为研究对象，构建包含 6,716 个 F-box-ORF 组合的 COMET 文库并导入细胞。研究发现，COMET 能可靠测量基线蛋白丰度，且在识别已知的 E3 - 底物相互作用方面表现出色，如 CCNF 对 SLBP、FBXW7 对 TP53 的调控。此外，研究还揭示了一些新的潜在相互作用关系，且发现 E3 - 底物相互作用存在复杂性，并非简单的 1:1 关系。
3. 大规模平行测试监测短半衰期转录因子（TFs）的 E3 连接酶：基于对 GATA2 的研究结果，研究人员推测短半衰期 TFs 的蛋白水解降解可能是普遍现象。为此，他们针对 108 个 TFs 构建了包含 83,484 个条形码构建体的 COMET 文库。研究发现，敲除 APC/C 的亚基 FZR1 可稳定 PTTG1 和 SOX9，表明它们可能是 APC/C 的底物，同时也发现了一些 TFs 在敲除特定 E3s 后出现不稳定的现象。
4. 对连接酶 - 底物相互作用景观进行分类：通过对实验数据的分析，研究人员将 E3 - 底物关系分为一对一、多对一、一对多和多对多四类，初步揭示了蛋白水解调控网络的连接性。
5. 对 COMET 提名的 E3 - 底物相互作用进行计算评估：利用 AlphaFold-Multimer 对 COMET 提名的 E3 - 底物对进行建模，发现 COMET 提名的 E3 - 底物对获得 AlphaFold-Multimer 支持的几率与 BioPlex 数据库中的 E3 - 蛋白对相似，且显著高于阴性对照，同时还通过实验验证了部分预测的相互作用。

研究结论和讨论部分指出，COMET 技术为研究 E3s 与底物之间的关系提供了一种高效且可扩展的实验框架。与传统的 GPS 筛选方法相比，COMET 能够更精准地研究非 CRL 单体泛素连接酶，还可能通过 CRISPR 激活 E3s 进行筛选。虽然目前在文库构建和 FACS 方面存在一定挑战，但可以通过预先筛选底物或反转研究框架（先计算预测再实验验证）来解决。此外，研究中也存在一些局限性，如测量丰度的相对性、潜在的间接相互作用以及假阴性和假阳性问题，但这些并不影响 COMET 技术在揭示蛋白降解调控网络、开发靶向治疗药物等方面的重要意义。它为深入理解细胞内蛋白质降解机制提供了关键数据，也为未来精准医学的发展奠定了坚实基础 。