RNA解旋酶HrpA在E. coli中拯救碰撞核糖体的分子机制及其对抗生素耐受性的影响

本期推荐：E. coli如何应对抗生素诱导的核糖体停滞？Campbell等发现RNA解旋酶HrpA通过ATP水解选择性拆分碰撞的双核糖体（disome），冷冻电镜结构揭示其同时结合两个核糖体并牵引下游mRNA的独特机制。该研究阐明HrpA缺失株对核糖体靶向抗生素高度敏感，为细菌耐药性机制提供了新见解，论文发表于《Molecular Cell》。

　　 在细菌生存的微观战场上，核糖体如同精密运转的蛋白质合成工厂，但频繁遭遇mRNA损伤、稀有密码子或抗生素导致的"交通堵塞"——核糖体停滞。这种"堵车"不仅阻碍后续翻译进程，未完成的短肽更可能变成细胞毒素。虽然已知^{E. coli}通过SmrB介导的mRNA切割和tmRNA救援途径处理停滞核糖体，但该途径对抗生素抑制的核糖体无效，且^ΔsmrB菌株并未表现出预期抗生素敏感性，暗示存在未知救援机制。这一谜团引发约翰霍普金斯大学医学院Allen R. Buskirk团队与慕尼黑大学Roland Beckmann团队的合作探索。

研究团队采用多学科交叉方法：通过抗生素敏感性筛选发现^ΔhrpA菌株对氯霉素（CAM）、红霉素等高度敏感；构建含SecM停滞肽或Arg₁₂稀有密码子的报告系统分析蛋白输出；利用Northern blot和5' RACE检测mRNA切割模式；核糖体图谱（ribosome profiling）量化核糖体排队现象；蔗糖梯度离心分离碰撞多聚体；体外重建系统验证HrpA的核糖体拆分活性；最终通过3.1 ?冷冻电镜解析HrpA-双核糖体复合物结构。

关键发现如下：

1. 遗传表型分析：^ΔhrpA菌株对氯霉素、红霉素等核糖体靶向抗生素呈现显著敏感性，而^ΔsmrB无此表型，提示HrpA在抗生素压力下起独特作用。报告基因实验显示HrpA通过减少全长蛋白产率促进翻译流产，且对需要3个以上排队核糖体的SmrB相比，HrpA仅需2个碰撞核糖体即可激活。

2. 碰撞特异性验证：通过设计不同长度（39/99/210 nt）的Arg₁₂报告基因，证实HrpA仅当核糖体有足够空间碰撞时才发挥作用。低剂量抗生素处理时，HrpA显著增加单体核糖体比例，而高剂量全面抑制翻译时无此效应，证明其选择性针对碰撞核糖体。

3. 体外重建实验：从^ΔhrpA菌株提取的多聚体经HrpA处理后，电泳图谱显示多聚体减少伴随亚基（30S/50S）和单体（70S）增加，该过程依赖ATP水解。RNase预处理实验揭示下游mRNA是HrpA活性的必需"手柄"。

4. 结构生物学突破：冷冻电镜捕捉到HrpA桥接两个核糖体的三种状态：①核心状态（Class I）显示HrpA的N端解旋酶模块（RecA1/RecA2）结合停滞核糖体mRNA入口，C端钩状结构域（Hook）锚定碰撞核糖体的h39螺旋；②次级状态（Class II）显示第二个HrpA分子辅助稳定复合物。特别值得注意的是，mRNA从停滞核糖体延伸进入解旋酶活性中心，为3'→5'解旋方向施加拉力提供结构基础。

5. 分子机制模型：HrpA通过C端结构域（CTR）识别碰撞界面，ATP水解驱动解旋酶对下游mRNA施加拉力，导致30S头部构象变化，促使停滞核糖体解离为亚基。与真核生物Slh1/RQT复合物相比，HrpA采用单解旋酶模块的简约设计，但功能趋同。

这项研究首次确立HrpA作为原核生物中保守的碰撞感应器，其核糖体拆分机制为理解细菌对抗生素的耐受性提供了新视角。特别值得注意的是，HrpA与SmrB形成功能互补的"双保险"系统：HrpA处理早期碰撞（2个核糖体）且保留mRNA完整性，适合抗生素压力下的救援；而SmrB处理严重堵塞（≥3个核糖体）通过mRNA切割彻底清除"路障"。该发现不仅拓展了对细菌翻译质量控制的认识，也为针对核糖体救援通路的抗菌药物设计提供了新靶点。