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为解决多药 ABC 转运蛋白工作机制细节不明的问题，多国研究人员聚焦 BmrA 展开研究。发现 R6G 和 H?chst33342 可窄化 BmrA 构象范围，提升 ATP 利用效率。该成果有助于理解微生物耐药机制，推荐科研读者一读。
在微生物的世界里，有一群 “运输小能手”，它们就是 ABC（ATP - Binding Cassette，ATP 结合盒式转运蛋白）转运蛋白。这些转运蛋白就像细胞的 “保镖”，利用 ATP 结合和水解产生的能量，把细胞内的各种有害物质 —— 也就是底物，运出细胞，从而保护细胞免受伤害，这一过程也导致了微生物产生耐药性。
其中，多药 ABC 转运蛋白更是厉害，能识别和运输各种结构毫无关联的底物，它们的 “口袋” 很大，还能灵活适应不同的配体。在执行任务时，它们会发生一系列复杂的构象变化，遵循交替访问机制（底物结合和释放时，转运蛋白的构象会在向内开放和向外开放两种状态之间切换）。不过，虽然这个机制大家都有所了解，但每一步的具体细节，以及它们之间的顺序，就像隐藏在迷雾中的宝藏，一直让科学家们争论不休。
就拿枯草芽孢杆菌的外排泵 BmrA 来说，它属于 IV 型多药 ABC 转运蛋白家族，能让枯草芽孢杆菌抵抗生物群落竞争者分泌的 cervimycin - C。BmrA 可以结合并运输许多不同的药物，像 doxorubicin、daunorubicin、H?chst33342、Rhodamine6G（R6G）、ethidium bromide 等等。它就像一个 “变形金刚”，有着很强的可塑性，能根据不同的运输分子调整自己的形态。然而，到目前为止，这种可塑性背后的分子细节，以及它是如何将 ATP 水解和药物转运这两个功能联系起来的，还缺乏详细的结构信息。
为了揭开这些谜团，来自丹麦奥胡斯大学、法国里昂第一大学等多个机构的研究人员，在《Nature Communications》期刊上发表了一篇名为 “Rhodamine6G and H?chst33342 narrow BmrA conformational spectrum for a more efficient use of ATP” 的论文。他们通过研究发现，R6G 和 H?chst33342 这两种药物能让 BmrA 的构象范围变窄，从而更高效地利用 ATP。这一发现就像为我们打开了一扇了解 ABC 转运蛋白工作机制的新大门，对理解微生物耐药性以及开发新的抗菌策略有着重要意义。
在这项研究中，研究人员主要用到了以下几个关键技术方法：
- 冷冻电镜技术（cryoEM）：通过这项技术，研究人员能够在原子水平上观察 BmrA 在不同状态下的结构，就像给 BmrA 拍 “高清照片”，看清它在结合不同配体和 ATP 时的构象变化。
- 结构酶学方法：将结构生物学和酶学结合起来，研究 BmrA 在结合底物和 ATP 过程中的结构变化以及酶活性的改变，探究其工作机制。
- 分子动力学模拟（MD simulations）：利用计算机模拟 BmrA 在脂质双分子层中的运动，从原子层面了解其动力学特征，以及药物结合对其运动的影响。
下面我们来详细看看研究人员都有哪些重要发现：
1. R6G 结合导致 ATP - Mg2?结合行为改变
BmrA 是个 “双胞胎”，由两个相同的单体组成，每个单体都有 1 个跨膜结构域（TMD）和 1 个核苷酸结合结构域（NBD）。研究人员发现，在没有 R6G 时，ATP - Mg2?与 BmrA 的结合是米氏（michaelian）类型，呈现出双曲线型曲线；但加入 R6G 后，结合曲线变成了 S 型，这表明 ATP - Mg2?的结合变成了协同行为。为了进一步探究，研究人员用冷冻电镜观察不同条件下 BmrA 的结构。结果发现，没有核苷酸时，BmrA 处于向内开放（IF）构象；随着 ATP - Mg2?的加入，它会逐渐转变为向外开放（OF）构象。在有 R6G 存在时，1:1 摩尔比的 ATP - Mg2?:BmrA 中，已经有 25% 的 BmrA 转变为 OF 构象；而没有 R6G 时，即使有 ATP - Mg2?，也观察不到 OF 构象。这说明 R6G 能让 BmrA 在更窄的 ATP - Mg2?浓度范围内，更高效地从 IF 构象转变为 OF 构象。
2. BmrA 在 IF 和 OF 构象中的灵活性
研究人员为不同分辨率的 3D 重建模型搭建了 “框架”，深入了解 IF 到 OF 构象的转换。在所有添加了 R6G 的重建模型中，都能清楚看到 R6G 的电子密度，而没有 R6G 的则看不到。在 OF 构象中，R6G 夹在每个半转运体的 TM1 - 2 和 TM5’ - 6’之间，促使 TM1 向 TM2 靠近。在 IF 构象中，R6G 也能结合在 TMD 的 TM 螺旋之间，而且可以有多种位置。R6G 结合还会让 BmrA 的 TM 螺旋和 NBD 发生重排，使两个 NBD 更直接地面对面，这暗示着 R6G 对 ATP 结合有影响。这些结构变化展示了 BmrA 在 IF 构象中的灵活性，以及 R6G 的变构效应。
3. R6G 对 BmrA 动力学和构象空间探索的影响
借助冷冻电镜结构的分辨率，研究人员可以观察到重建模型中粒子间的差异，从而了解蛋白质的运动。他们用一种叫 3DVA 的方法分析发现，R6G 会影响 BmrA 的运动。在没有 R6G 时，NBD 会进行多种运动，比如围绕 V363 和 E453 旋转，以及整体振荡；而有 R6G 存在时，围绕 E453 的旋转幅度减少了一半以上，整体振荡也大大减弱。这表明 R6G 会减少 NBD 的构象空间探索，虽然这和我们预期的 ATP - Mg2?结合的协同性有些矛盾，但结合分子动力学模拟结果，这一现象是有意义的。
4. 分子动力学模拟研究 R6G 结合的影响
研究人员对含有和不含有 R6G 的 BmrA 进行分子动力学模拟。结果发现，两种情况下 BmrA 都能运动，但 R6G 存在时，BmrA 的构象空间更集中，NBD 的闭合方式也不同。没有 R6G 时，两个 NBD 以协同的方式闭合；有 R6G 时，NBS 的闭合是不对称的，一个 NBS 的变窄更明显。此外，R6G 在结合口袋里比较 “安分”，只在附近活动，而且它还会阻止 TM 螺旋直接闭合。这些结果和冷冻电镜数据相吻合，都表明 R6G 会影响 BmrA 在 IF 构象中的构象空间探索。
5. H?chst33342 对 BmrA 动力学和构象空间探索的影响
研究人员还研究了其他配体对 BmrA 的影响，比如 H?chst33342 和 Doxorubicin。它们和 BmrA 的结合亲和力与野生型 BmrA 相似，而且都能像 R6G 一样诱导 ATP - Mg2?的协同结合。研究人员解析了 E504A 与 H?chst33342 结合的冷冻电镜结构，发现它和 R6G 结合的结构有相似之处，都能引起 BmrA 的一些结构变化。通过 3DVA 分析发现，H?chst33342 对 BmrA 运动的影响比 R6G 更大，它几乎消除了 NBD 之间的闭合运动。这再次证实了配体结合会影响 BmrA 的构象空间探索。
6. 配体对 ATP 酶和转运活性的影响
由于 R6G 能让 BmrA 在窄浓度范围内快速从 IF 转变为 OF 构象，研究人员就研究了这个浓度范围内 ATP 酶活性的变化。结果发现，在低 ATP - Mg2?浓度下，R6G、Doxorubicin 和 H?chst33342 都能刺激 ATP 酶活性；但在高浓度下则没有这种刺激作用。研究人员还研究了 H?chst33342 和 Doxorubicin 的转运效率，发现它们在低 ATP - Mg2?浓度下，转运效率与 ATP 水解的耦合更紧密；高浓度时则出现解耦现象。这表明药物扩散到结合口袋的速率可能是转运的限制因素。
综合这些研究结果，研究人员认为，底物结合位点和 NBD 之间的通信在 ABC 转运蛋白中起着关键作用。R6G 和 H?chst33342 等药物与 BmrA 结合后，会通过变构效应影响 NBD 的结构和运动，减少其构象空间探索，从而优化 ATP 结合位点的定位。这种变构效应在低 ATP 浓度时尤为重要，它能刺激药物转运效率，帮助细胞在 ATP 稀缺的情况下更高效地排出有害物质，保护细胞免受伤害。而在 ATP 充足时，这种变构效应的重要性就会降低。
这项研究首次直接从结构层面揭示了配体对蛋白质动力学的影响，为我们理解 ABC 转运蛋白的工作机制提供了新的视角。它就像一把钥匙，为未来开发针对 ABC 转运蛋白的新型抗菌药物打开了希望之门，有助于我们更好地应对微生物耐药性问题，守护人类健康。
