化废为宝！利用中间型脉孢菌将开心果脱壳废料变身高蛋白真菌生物质

为解决开心果脱壳废料（PBM）的有效利用问题，伊朗阿米尔卡比尔理工大学研究人员开展利用中间型脉孢菌（Neurospora intermedia）转化 PBM 的研究。结果表明能制得高蛋白真菌生物质，该成果对生物经济和环保意义重大，值得一读。

　　

在全球，开心果（Pistacia vera L.）凭借丰富的营养和健康益处，受到广泛种植，像伊朗和美国都是重要产地。随着人们对开心果的喜爱与日俱增，其产量也不断攀升。但开心果脱壳过程产生的大量废弃物 —— 开心果副产品混合物（Pistachio byproduct mixture，PBM），却成了让人头疼的问题。

PBM 主要由叶子、果簇和绿色外壳组成，每年的产量相当可观，在 2023 年就有约 60 万吨。它可不是毫无用处的废料，里面富含酚类化合物（干基约 8.6 - 9.3%）、碳水化合物（中性洗涤纤维 25.5 - 31.8%）和矿物质等营养成分。然而，PBM 属于木质纤维素生物质，结构复杂，酶和微生物很难接触到其内部，这给生物转化带来了极大的困难。要是处理不当，比如直接在农田丢弃，或者未经预处理就用作动物饲料，不仅会污染环境，还会造成资源浪费，引发一系列经济问题。

以往针对 PBM 的研究，大多集中在从废料中提取化合物，对生物转化利用方面的探索少之又少。虽然也有一些物理、化学和热化学的处理方法，但都存在各自的弊端。像物理方法中的筛分、研磨，只能将 PBM 变成适合土壤改良的小颗粒；提取等物理技术，以及微波辅助等化学或物理化学方法，虽然能提取出多酚、黄酮类等生物活性化合物，用于食品和制药行业，但这些方法往往需要严苛的操作条件、大量的化学试剂，还会产生危险的废弃副产品。相比之下，利用发酵和厌氧消化等生物方法来处理 PBM，不仅更加环保，能耗也更低。

在众多生物方法中，丝状真菌凭借强大的酶解能力脱颖而出，成为转化农业废弃物的 “得力助手”。中间型脉孢菌（Neurospora intermedia）作为丝状真菌的一种，能够将复杂的淀粉和纤维素分解为简单糖类，进而合成富含蛋白质、脂肪和必需氨基酸的生物产品，还能产生乙醇、有机酸等有价值的代谢物。此前就有研究利用中间型脉孢菌，成功将生物乙醇工业废料和面包废料转化为蛋白质和色素，也有研究用它处理乳制品废料，生产出优质生物质以及生物基化学品。

但到目前为止，虽然 PBM 资源丰富，生物转化潜力巨大，可利用发酵等生物方法将其转化为高价值产品的研究却极为罕见。为了填补这一空白，来自伊朗阿米尔卡比尔理工大学（Amirkabir University of Technology）等机构的研究人员，在《Scientific Reports》期刊上发表了一篇名为 “Production of protein - rich fungal biomass from pistachio dehulling waste using edible Neurospora intermedia” 的论文。他们成功找到了一种利用中间型脉孢菌和热水提取预处理技术，将 PBM 转化为富含蛋白质的真菌生物质的新方法，为 PBM 的可持续利用开辟了新途径，这一成果对推动生物经济发展意义重大。

在这项研究中，研究人员运用了多种技术方法。首先是预处理技术，他们采用热水处理法，在 90°C 下处理 PBM 90 分钟，固液比控制在 0.1，处理后的液体作为后续培养的主要培养基。然后是真菌培养技术，在 250mL 摇瓶中进行中间型脉孢菌的培养，通过改变初始 pH、培养时间、温度等条件，研究不同因素对真菌生长的影响。此外，还运用了多种分析技术，像用凯氏定氮法测定干生物质中的总蛋白质含量；用高效液相色谱（HPLC）分析糖类和酚类化合物；用气相色谱 - 质谱联用仪（GC - MS）对培养基成分进行鉴定等。

下面来看看具体的研究结果：

1. 预处理和培养基制备：在预处理实验前，研究人员对 PBM 的特性进行了分析。结果发现，PBM 水相中总碳水化合物含量极少，相比之下，酚类化合物和化学需氧量（COD）较高，这意味着糖类不太能支持丝状真菌的大量生长，但酚类化合物和 COD 对中间型脉孢菌的生长很有潜力。经过热水提取预处理后，约 38% 的 PBM（为培养基提供碳源和营养的水溶性提取物）转移到水相，培养基的总 COD 为 17.9g/L，凯氏氮含量极少（约 0.02%）。HPLC 分析显示，培养基中葡萄糖和鼠李糖含量分别为 0.28g/L 和 0.52g/L，进一步证实糖类含量低；而没食子酸和槲皮素等酚类化合物含量分别为 2936ppm 和 67ppm。GC - MS 分析则鉴定出培养基中 72 种化合物，其中乙醛（36.5%）、3,4 - 二羟基苯甲酸（7.4%）等是主要成分。
2. 培养时间的影响：研究人员研究了培养时间对生物质产量、pH 和蛋白质含量的影响。结果发现，培养 72 小时时，真菌生物质浓度达到最高，为 6.7g/L，蛋白质含量为 20.4%（干重基础），相当于每千克 PBM 可产生 26.8g 干真菌生物质。培养时间过长或过短，生物质产量都会明显下降。中间型脉孢菌在该培养基中的生长滞后期约为 8 小时，培养 15 小时时生物质生产率达到最高，为 125mg?L?1?h?1。在 120 小时的培养过程中，pH 从 5.5 升高到 7.3，72 小时时 pH 为 7，此时生物质产量最高。这是因为真菌培养过程中，蛋白质水解或生化反应（如乙醇生产）通常会导致 pH 升高。另外，研究还发现，培养 72 小时后，真菌生物质产量与初始总 COD 的比值为 0.37g/g，这一结果与之前利用鱼类工业副产品培养米根霉（Rhizopus oryzae）的研究结果相近，也与一些利用丝状真菌处理工业废水的研究结果相符。收获真菌生物质后，对剩余培养基进行 GC - MS 分析，鉴定出 64 种化合物，其中 45 种与初始培养基中的化合物一致，其余化合物含量极少。这表明丝状真菌能够适应含有酚类、芳香族和醇类化合物的环境，并降解多种芳香族化合物，其降解机制与多种酶促反应有关。
3. 初始 pH 的影响：初始 pH 对真菌生长影响显著。72 小时后，初始 pH 为 5.5 时，生物质产量最高，为 6.7g/L，蛋白质含量为 20.4 ± 0.5%，与最佳培养条件下的蛋白质含量相同。而初始 pH 降低到 3 和 4.5 时，真菌生物质产量大幅下降，pH 为 4.5 时生长受限，pH 为 3 时几乎不生长，这是因为酸性条件（pH 低于 5）下微生物活性很低。在 pH 5.5 时，真菌以丝状菌丝团形式生长；在 pH 4.5 时，颗粒状生长更为明显，且此时乙醇产量更高，72 小时后，pH 4.5 时乙醇产量为 0.35g 乙醇 / 初始总 COD，pH 5.5 时为 0.29g 乙醇 / 初始总 COD，这与之前关于中间型脉孢菌菌丝颗粒形成的研究结果一致。此外，研究还发现，在整个培养过程中将 pH 调节并维持在 5.5，72 小时后可获得 8.8g/L 的干真菌生物质，蛋白质含量为 18.6%，生物质产量与初始总 COD 的比值为 0.49g/g。这表明稳定的 pH 环境能显著提高中间型脉孢菌的生物质产量，因为在微酸性 pH 条件下，酶活性更高，营养物质吸收更好。
4. 温度的影响：中间型脉孢菌是嗜温菌株，研究人员在初始 pH 为 5.5 的条件下，探索了 20 - 45°C 温度范围内对其生长的影响。结果表明，30°C 时生物质生长最佳，产量为 6.7g/L，这与之前的研究结果相符。从优化生物质生长和能源效率的角度来看，30°C 是最适宜的生长温度。温度对中间型脉孢菌生物质生长的影响较为复杂，温度过低（约 20°C）时，酶反应效率和细胞生长过程减缓，营养物质吸收也会受到影响；温度过高则会损害细胞蛋白质、脂质、DNA，使蛋白质变性，破坏细胞膜完整性，嗜温真菌生长的上限约为 48°C。
5. 接种方法的影响：PBM 提取物培养基中的酚类和芳香族化合物，以及接种物的驯化和中间型脉孢菌的适应，都有助于促进真菌生物质的生长。研究人员将 PBM 初级培养基稀释两倍，接入 2.5% v/v 的孢子悬液，在 30°C、初始 pH 为 5.5 的条件下发酵 24 小时，然后向初级 PBM 培养基中加入 10% v/v 的预培养菌丝团溶液。72 小时后，获得了 7.9g/L 的干真菌生物质，蛋白质含量为 20.2%，生物质产量与初始总 COD 的比值为 0.44g/g。虽然蛋白质含量与最佳真菌生物质蛋白质含量（20.4%）差异不大，但生物质产量提高了 18%。这是因为预培养接种法能使接种物更均匀、更集中，孢子萌发更快，营养物质吸收更好，这也与之前关于接种方法的研究结果一致。
6. 添加氮源的影响：在不添加氮源的 PBM 培养基中，最佳操作条件（培养 72 小时、温度 30°C、初始 pH 5.5）下可获得 6.7g/L 的干真菌生物质，此时 COD/N 比为 90。在缺氮的 PBM 培养基中添加氮源，能提高生物质和蛋白质的生产效率。将 COD/N 比调整为 20 和 10 时，干真菌生物质分别增加到 8.1g/L 和 7.5g/L。添加硝酸钠（NaNO?）作为无机氮源，能促进中间型脉孢菌的生物质生长，这反映出大多数真菌更倾向于利用无机氮。随着 COD/N 比的降低，真菌生物质中的蛋白质含量显著增加，COD/N 比为 20 和 10 时，蛋白质含量分别达到 27.1% 和 31.4%，比不添加氮源时分别提高了约 33% 和 54%。在响应真菌生物质生长方面，COD/N 比为 20 时，每克初始总 COD 可产生 0.45g 真菌生物质。虽然在工业环境中添加氮源会增加处理成本，但能获得高价值产品，如提高真菌生物质中的蛋白质含量，适合非反刍动物食用。此外，将富含蛋白质或氮的废料或废水（如鱼类加工废水）添加到 PBM 中作为氮源，值得进一步研究，这可能为 PBM 的生物转化和废水处理提供新的思路。

研究结论表明，利用中间型脉孢菌和热水提取预处理方法，将 PBM 转化为富含蛋白质的真菌生物质，是一种极具前景的策略。通过预培养接种、添加氮源和调节培养过程中的 pH 值，可以显著提高真菌生物质的产量和蛋白质含量，最高真菌生物质产量可达 0.49g/g 初始总 COD，蛋白质含量可达 27.1%。这项研究为 PBM 的可持续管理和高价值利用提供了新途径，通过构建完整的价值链，将 PBM 转化为高价值产品，在推动生物经济发展方面迈出了重要一步。它不仅有助于增强区域经济，还对环境保护有着重要意义，为实现可持续发展目标提供了有力支持。