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为解决癌症治疗效果监测难题，BillionToOne, Inc 的研究人员开展甲基化 ctDNA 定量监测研究。他们研发 Northstar Response 检测法，能精准量化甲基化 ctDNA。该成果对癌症治疗意义重大，强烈推荐科研读者阅读。
在癌症治疗的领域中，精准医疗正逐渐成为改善患者预后的关键。个性化癌症治疗就像为患者量身定制的 “抗癌武器”，能显著延长许多患者的生命，提升他们的生活质量。然而，在治疗过程中，如何准确又及时地监测治疗效果，却成了一道难以跨越的 “关卡”。
目前，影像学检查是评估癌症患者病情的常用方法，可它就像戴着一副 “模糊的眼镜”，存在不少缺陷。肿瘤的异质性使得不同部位的肿瘤细胞对治疗的反应各不相同，在影像上难以准确呈现；接受免疫治疗的患者还可能出现假进展的情况，明明治疗有效，影像却显示病情在恶化；肿瘤周围的疤痕组织，以及像骨头、腹膜这些在影像中对比度低的组织，也会干扰判断。而且，影像学检查的主观性很强，不同的医生看同一幅影像，可能会有不同的解读，再加上检查频率受限，往往几个月才能做一次，这就导致评估治疗效果的时间被拉长，患者可能在病情已经进展了，却还没能及时发现。
除了影像学检查，通过追踪循环肿瘤 DNA（ctDNA）中体细胞突变的变异等位基因分数（VAF）来监测治疗效果的方法也存在问题。肿瘤初治（tumor-naive）的靶向 panel 检测方法，在很多晚期癌症患者身上，根本检测不到体细胞突变，大约 10% - 20% 的患者会面临这种情况，这使得该方法在治疗效果监测上 “无能为力”。就算检测到了变异，变异的数量也有限，VAF 通常很小，这就导致变异分子数量少，检测结果的变异系数（CV）高，每次测量都像是在 “碰运气”，充满了噪音和变数，很难通过多次测量来准确判断病情变化。肿瘤知情（tumor-informed）检测方法虽然能更好地检测到突变，但它需要先进行肿瘤活检，不仅有创，有时候还因为各种原因无法进行，而且这种方法只能追踪固定的一组体细胞突变，当肿瘤在治疗压力下发生克隆异质性变化时，就无法准确反映肿瘤的真实情况了。
为了解决这些棘手的问题，BillionToOne, Inc 的研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Molecular counting enables accurate and precise quantification of methylated ctDNA for tumor-naive cancer therapy response monitoring” 的论文。他们研发出了一种全新的肿瘤初治液体活检检测方法 ——Northstar Response，通过对甲基化 ctDNA 进行精准定量，为癌症治疗效果监测带来了新的希望。这一成果意义重大，有望改变临床决策的制定方式，为癌症患者提供更有效的治疗方案。
研究人员在开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。首先，他们借助 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 数据库，筛选出癌症组织中相较于正常组织高甲基化的位点，设计出针对 500 多个这样位点的多重 PCR 检测方法。其次，利用定量计数模板（QCT）技术，准确计算每个位点的甲基化分子数量，有效避免了扩增偏差的干扰。最后，通过下一代测序（NGS）技术对样本进行测序分析，获取关键数据 。
下面我们来详细看看研究人员都得到了哪些重要结果。
高甲基化位点选择和检测方法设计
研究人员就像一群 “寻宝者”，从庞大的基因组 “宝藏库” 中寻找与癌症相关的高甲基化位点。他们分析了 TCGA 数据库，对比肿瘤组织和正常组织的甲基化数据，挑选出那些在肿瘤组织中高甲基化的位点。为了确定检测所需的位点数量，他们进行了复杂的理论计算。假设只有分子采样的泊松噪声，不考虑其他背景噪声，要达到 3% 的变异系数，就需要对至少 1000 个甲基化分子进行采样。经过一系列推算，最终确定大约需要 500 个位点才能实现目标。之后，他们设计引物，构建了能靶向 500 多个扩增子的多重检测方法。而且，这些靶向的 CpG 位点在多种癌症类型中都呈现高甲基化状态，还与癌症生物学的多个方面相关，比如涉及到一些已被临床验证的癌症生物标志物基因，以及参与发育、形态发生和细胞分化等生物过程的基因 。
QCT 用于精准定量、背景扣除和标准化
在检测过程中，研究人员利用 QCT 技术来准确计算每个位点的输入甲基化分子数量。QCT 就像是一个个 “分子计数器”，它有着和样本分子相似的引物结合位点，还带有独特的分子标识符（EMI）。通过它，研究人员能根据平均每个 QCT 分子的读数，推算出样本分子的读数，进而准确计算出甲基化样本分子的数量。同时，为了去除非癌症背景甲基化的干扰，他们从配对的 cfDNA 中减去血沉棕黄层（buffy coat）中测量到的甲基化分子数量。此外，还设计了针对在所有组织中都高度甲基化的 CpG 位点的扩增子和 QCT，用于估算输入 DNA 的总量，实现数据的标准化，最终计算出肿瘤甲基化评分（Tumor Methylation Score） 。
肿瘤甲基化评分在人工合成样本中的定量性能
为了检验 Northstar Response 检测方法的准确性和精确性，研究人员制作了人工合成样本，就像是在实验室里模拟真实的癌症情况。他们把剪切后的肿瘤 DNA 按照不同比例（0%、0.25%、0.5%、1% 和 2% 肿瘤分数）掺入到剪切后的血沉棕黄层 DNA 中，用两个不同的肿瘤（一个来自 IV 期肺腺癌，另一个来自 IV 期乳腺腺癌）制作了多组样本。结果发现，肿瘤甲基化评分与人工合成的肿瘤分数呈线性关系，即使肿瘤分数低至 0.25%，这种线性关系依然存在。而且，该评分在所有测试的肿瘤分数下变异系数都小于 20%，在 2% 肿瘤分数时更是低至 6% 左右，这表明 Northstar Response 能高精度、高精准度地对肿瘤 DNA 进行定量 。
利用肿瘤甲基化评分对肿瘤分数变化进行分类
这个检测方法的一大重要作用，就是监测甲基化 ctDNA 丰度随时间的变化。研究人员通过比较不同样本对的肿瘤甲基化评分，判断肿瘤分数是否发生了变化。结果显示，该方法能以高灵敏度和特异性识别肿瘤分数的变化。例如，从 1% 肿瘤分数降低到 0.5%，或者从 0.25% 增加到 0.5% 这样的变化，都能被准确识别。对于一些较小的变化，比如 0.5% 的绝对肿瘤分数增加，检测方法也能有较高的准确性（AUC > 0.97）。虽然区分更小的变化（如 0.25% 的增加）更具挑战性，但在一定情况下（如 1.75% 和 2% 肿瘤分数的比较）也能实现区分 。
临床血浆样本中的分析验证
在临床血浆样本的研究中，研究人员选取了晚期肺癌患者队列，同时用 Northstar Response 和肿瘤初治靶向 panel 检测方法对样本进行处理。他们发现，肿瘤甲基化评分与平均 VAF 以及最大 VAF 都呈正相关。而且，在大多数患者中，肿瘤甲基化评分和基于 VAF 的检测方法在 ctDNA 动态变化趋势上是一致的。进一步研究还发现，当肿瘤甲基化评分大于 1000 时，cfDNA 和肿瘤样本中的甲基化位点在身份和相对分子丰度上高度保守，而血沉棕黄层的甲基化贡献很少 。
与使用 VAF 的肿瘤初治靶向 panel 检测方法的精度比较
研究人员将 Northstar Response 检测方法与常用的基于 VAF 的肿瘤初治检测方法进行精度对比。他们用含有多种突变的 DNA 样本进行实验，结果发现，Northstar Response 检测方法的变异系数比基于 VAF 的检测方法低很多，在检测低肿瘤分数样本时，精度优势更为明显。即使假设基于 VAF 的检测方法没有其他额外噪音，也需要检测至少 10 个突变才能达到 Northstar Response 在 2% 肿瘤分数样本中的精度 。
在几种不同肿瘤起源组织中的分析验证
研究人员还测试了 Northstar Response 在多种不同肿瘤组织中的性能。他们用来自 12 种不同组织的 54 个实体瘤制作人工合成样本，发现该检测方法在 1% 和 2% 肿瘤分数样本中的肿瘤甲基化评分有明显差异（除了一个肺神经内分泌肿瘤可能由于肿瘤纯度低差异不明显）。而且，在判断 2% 肿瘤分数样本相较于 1% 肿瘤分数样本的肿瘤甲基化评分变化时，检测方法的灵敏度高达 98.1% 。
临床结果与结局的比较
研究人员对癌症患者治疗前后的样本进行检测，观察肿瘤甲基化评分的变化，并与临床结局进行对比。他们发现，肿瘤甲基化评分的变化能很好地反映癌症治疗的动态过程。比如，患者开始治疗后，肿瘤甲基化评分大多会下降，而在治疗后期，部分患者的评分又会升高。而且，肿瘤甲基化评分与临床结局高度一致，评分升高往往预示着病情进展，评分降低则与部分缓解的临床结局相关 。
综合这些研究结果，Northstar Response 作为一种新型的肿瘤初治、基于甲基化的检测方法，成功克服了现有液体活检方法在癌症治疗效果监测中的诸多技术难题。它通过对甲基化 ctDNA 的精准定量，在多种肿瘤类型和患者中都展现出了高准确性和高灵敏度。这不仅为癌症治疗效果监测提供了更可靠的手段，还有望让医生更早地发现肿瘤进展或治疗反应，及时调整治疗方案，改善癌症患者的预后。不过，虽然这项研究成果意义重大，但仍需要进一步扩大临床研究队列，深入探索肿瘤甲基化评分在不同癌症类型中的临床意义，以及该检测方法在检测更小但仍有意义的分子变化方面的能力，让这一技术能更好地服务于临床实践，为更多癌症患者带来希望 。
