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为解决 RiFTR1 的铁氧化酶伙伴及在 AM 共生中的意义问题，西班牙格拉纳达农业化学和食品技术研究所等的研究人员开展相关研究，发现 RiFTR1 无需铁氧化酶伙伴，且促进菌根定植。该成果有助于理解 AM 真菌与植物的共生关系，值得科研读者一读。
在神秘的植物与微生物共生世界里，铁元素扮演着至关重要的角色。铁是生命必需的金属元素，然而它就像一把双刃剑，适量的铁对生物的正常生长和代谢不可或缺，但浓度过高时又会变得极具毒性。在自然界中，铁虽然储量丰富，可由于大气中的氧气会将其氧化成不溶性的氢氧化铁，导致其生物可利用性极低。这就好比在沙漠中，周围全是沙子，可真正能解渴的水却少之又少。因此，无论是植物还是微生物，都进化出了一套套精密的机制来摄取和调节体内的铁含量，以维持铁稳态。
丛枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AM 真菌）与植物形成的共生关系，是植物增加养分供应的一种古老而有效的策略。AM 真菌就像是植物的 “小帮手”，它们在土壤中构建起庞大的外部菌丝网络，能够突破植物根系周围养分耗尽区域的限制，吸收各种养分，包括磷、氮，还有铁、铜、锌等微量元素。作为回报，植物会为这些真菌提供固定碳，以糖和脂质的形式。此前已有多项研究表明，AM 真菌在植物铁吸收过程中发挥着重要作用。
在这个共生体系里，有一种名为不规则根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）的 AM 真菌备受关注。之前的研究发现，它利用一种高亲和力的还原途径来摄取铁，而这一过程由铁转运蛋白 RiFTR1 介导。但关于 RiFTR1，仍有许多谜团等待解开。比如，在其他真菌中，与 RiFTR1 类似的铁转运蛋白往往需要与铁氧化酶（ferroxidase）搭档才能完成铁的摄取工作，可在不规则根孢囊霉中，RiFTR1 的铁氧化酶伙伴却一直未被找到。而且，RiFTR1 在 AM 共生中的具体意义也尚不明确。为了揭开这些谜团，来自西班牙格拉纳达农业化学和食品技术研究所（Estación Experimental del Zaidín, CSIC）等多个机构的研究人员，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “The Rhizophagus irregularis permease RiFTR1 functions without a ferroxidase partner for reductive iron transport” 的论文。他们的研究发现，RiFTR1 在铁转运过程中并不需要铁氧化酶伙伴，并且它在促进菌根定植方面发挥着重要作用，这一成果为我们理解 AM 真菌与植物之间的相互作用提供了全新的视角。
为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们通过在不规则根孢囊霉基因组数据库中进行搜索，鉴定出潜在的多铜氧化酶（Multicopper Oxidase，MCO）基因，这些 MCO 基因可能编码铁氧化酶；利用实时荧光定量 PCR 技术，对不同条件下的真菌基因表达进行定量分析，从而了解基因的表达变化情况；构建酵母突变体，进行异源表达实验，以此探究蛋白的功能和相互作用；还采用激光显微切割技术，获取特定细胞类型，分析基因在不同真菌结构中的表达差异。
下面我们来详细看看研究人员都有哪些重要发现。
R. irregularis 基因组中至少有 9 种多铜氧化酶
为了找到 RiFTR1 的铁氧化酶伙伴，研究人员在不规则根孢囊霉的基因组数据库里展开了一场 “大搜索”。他们成功鉴定出 9 个可能编码 MCO 的基因（RiMCO1 - RiMCO9），并通过 RACE 实验对其中部分基因的 cDNA 序列进行了验证。这些预测的 RiMCO 蛋白长度各不相同，氨基酸序列之间的相似度也有所差异。进一步分析发现，它们都含有三个典型的铜蓝蛋白样结构域，并且具备与铜配位相关的保守区域。通过系统发育分析，研究人员发现这些 RiMCOs 都聚集在铁氧化酶 / 漆酶分支中，但没有一个与 Fet3 型铁氧化酶聚在一起。这表明，虽然不规则根孢囊霉中没有严格意义上的 Fet3 型铁氧化酶，但 RiMCO1、RiMCO3、RiMCO6、RiMCO8 和 RiMCO9 等基因编码的蛋白，因为含有对铁氧化至关重要的残基和预测的跨膜结构域，很有可能是铁转运蛋白的铁氧化酶伙伴。
RiMCOs 在根内和根外菌丝中差异表达
研究人员接着想知道这些 RiMCOs 基因在根内菌丝（Intraradical Mycelium，IRM）和根外菌丝（Extraradical Mycelium，ERM）中的表达情况有何不同。于是，他们利用实时荧光定量 PCR 技术，对不同菌丝中的基因表达进行了检测。结果发现，在 ERM 中，RiMCO1、RiMOC4 和 RiMCO5 表达量较高，而在 IRM 中，RiMCO2 的表达量最高。而且，RiMCO1 和 RiMCO5 在 ERM 中的表达量比在 IRM 中高出约 10 倍。不过，编码典型铁氧化酶特征蛋白的基因，它们的表达与铁转运蛋白 RiFTR1 的表达并不平行，RiFTR1 在 IRM 中的表达更高。这就好像不同的基因在不同的 “岗位” 上各司其职，它们的 “工作强度” 在不同的菌丝部位有所不同。
Fe 调节 RiMCO1、RiMCO3 和 RiMCO4 基因表达
由于真菌铁氧化酶的表达通常受铁离子调控，研究人员猜测，在不规则根孢囊霉中，与铁转运蛋白 RiFTR1 相互作用的潜在铁氧化酶基因表达可能也会受到铁浓度的影响。为此，他们在不同铁浓度的培养基中培养 ERM，然后检测 RiMCOs 基因的转录水平。结果显示，当 ERM 在缺铁培养基中生长并暴露于铁螯合剂时，RiMCO1 和 RiMCO3 的基因表达分别上调了 2.3 倍和 1.8 倍；而当培养基中含有高浓度铁（45 mM）时，RiMCO4 的表达上调了 3.5 倍，RiMCO1 的表达则略有下调。这表明，RiMCO1 和 RiMCO3 可能是铁转运蛋白 RiFTR1 的伙伴，而 RiMCO4 在高浓度铁环境下可能也发挥着与铁相关的作用。
RiFTR1 在酵母中可在无铁氧化酶伙伴参与的情况下摄取铁
为了验证 RiMCO1 和 RiMCO3 是否真的能与 RiFTR1 协同工作，研究人员进行了一系列酵母互补实验。他们将 RiMCO1 和 RiMCO3 的全长 cDNA 导入缺乏 Fet3 铁氧化酶活性的酿酒酵母突变体（Δfet3）中，结果发现，这些表达 RiMCO1 和 RiMCO3 的突变体在缺铁条件下的生长情况明显改善，这说明 RiMCO1 和 RiMCO3 能够氧化亚铁离子为高铁离子，并与酵母的 Ftr1 通透酶组装，帮助突变体摄取铁。然而，当研究人员将 RiFTR1 分别与 RiMCO1、RiMCO3 共表达，导入缺乏 Fet3 铁氧化酶以及低亲和力和高亲和力铁通透酶的三重突变体（Δfet3Δfet4Δftr1）中时，却有了意外发现：在添加 30 μM 铁的培养基中，表达 RiFTR1 的酵母细胞就能恢复生长，而且共表达 RiMCO1 或 RiMCO3 并没有进一步促进酵母生长。在另一个缺铁的双突变体（Δfet3Δfet4）实验中也得到了类似结果。此外，通过对 RiFTR1 - mRuby2 融合蛋白的定位分析，发现该蛋白主要定位于细胞膜上。这一系列结果表明，在酵母中，RiFTR1 在缺铁条件下摄取铁时，并不需要铁氧化酶伙伴的协同作用，其铁转运机制更类似于植物的 IRT1 铁转运蛋白，而与其他真菌中常见的 Ftr1 铁转运蛋白机制不同。
RiFTR1 主要在含有丛枝的细胞中表达，其过表达促进丛枝发育
之前的研究已经发现，RiFTR1 在菌根根中的表达量高于 ERM。为了更深入了解其具体定位，研究人员利用 RNA - Seq 数据分析了 RiFTR1 在不同真菌结构中的表达情况。结果显示，RiFTR1 在含有丛枝的根细胞中的表达量比在根内菌丝和 ERM 中高出 43 倍，这表明它可能在丛枝发育和功能维持过程中对铁稳态的调节起着重要作用。
为了探究 RiFTR1 在 AM 共生中的功能，研究人员尝试通过宿主诱导基因沉默（Host - Induced Gene Silencing，HIGS）技术对其进行失活研究，但未能成功。于是，他们采用了另一种方法 —— 在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）根中异位过表达 RiFTR1，并进行菌根定植实验。结果发现，过表达 RiFTR1 的植株被不规则根孢囊霉定植的程度更高，丛枝数量比对照植株多 4 倍，而且这种变化与共生磷酸盐转运蛋白 MtPT4 的表达增加有关，与真菌翻译延伸因子 RiEFα 的表达无关。这说明铁稳态在丛枝发育或功能维持中可能起着尤为重要的作用，而 RiFTR1 在这一过程中扮演着关键角色。
综合以上研究结果，研究人员得出结论：不规则根孢囊霉的铁转运蛋白 RiFTR1 在功能上与其他真菌的同源蛋白不同，它不需要多铜氧化酶作为伙伴就能发挥作用，其铁转运机制更类似于植物的 IRT1 系统。此外，RiFTR1 在 AM 共生中具有重要意义，它在含有丛枝的细胞中高度表达，过表达 RiFTR1 能够促进菌根定植和丛枝发育，这表明铁元素在 AM 共生中对维持丛枝的正常功能起着关键作用。
这项研究成果意义非凡。它打破了以往人们对真菌铁摄取机制的认知，揭示了不规则根孢囊霉独特的铁转运方式，让我们认识到 AM 真菌的铁摄取策略可能更接近植物，而非传统认知中的真菌途径。这不仅有助于我们深入理解 AM 真菌与植物之间的共生关系，还为进一步探究植物与微生物相互作用过程中的铁营养调控机制提供了重要线索。未来，研究人员可以基于这些发现，进一步研究不同环境条件下 RiFTR1 的功能变化，以及其他 AM 真菌的铁摄取机制，为提高植物对铁元素的利用效率、改善植物生长和健康状况提供理论支持，说不定在农业生产中，能帮助农作物更好地吸收铁元素，茁壮成长呢！
