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为解决鱼类肌肉细胞系研究不足及 Labeo rohita 肌肉细胞蛋白质组未被研究的问题，中国水产科学研究院中央渔业教育研究所等机构的研究人员，开展其肌肉细胞蛋白质组研究，揭示相关蛋白表达，为培养肉研究奠基，值得一读。
在神秘的生命科学领域，鱼类肌肉的生长一直是科学家们关注的焦点。与其他脊椎动物不同，鱼类的肌肉生长贯穿其一生，这一独特的特性使鱼类成为研究培养肉生产的绝佳模型。鱼类肌肉不仅会出现肥大（细胞体积增大），还会发生增生（细胞数量增加），这对于理解肌肉细胞生长有着极大的帮助。
随着细胞培养肉研究的兴起，开发鱼类肌肉细胞系变得至关重要。通过建立细胞系，科学家们可以深入探究肌肉细胞如何生长、成熟为有活力的肌肉组织，从而更好地模拟自然肌肉生长过程，为培养肉生产提供理论支持。然而，目前硬骨鱼（teleost）除了大菱鲆（Scophthalmus maximus）、斑马鱼（Danio rerio）和长丝（Wallago attu）等少数鱼类外，大多数还没有连续的肌肉细胞系，相关研究也处于起步阶段。即便有了细胞系，多数也未应用于培养肉研究。
同时，在理解肌肉生长和分化的分子机制方面，仅仅研究转录调控因子是不够的。蛋白质作为生命活动的直接执行者，分析蛋白质组（proteome）谱对于揭示肌肉生长和分化过程中表型变化背后的分子机制至关重要。蛋白质组学研究可以帮助科学家了解不同生化过程在细胞层面是如何协调的，从而为控制培养肉的质地和质量提供依据。但目前，印度露斯塔野鲮（Labeo rohita，一种在南亚广泛养殖的淡水鱼）肌肉细胞的蛋白质组表达尚未得到研究。
为了解决这些问题，来自中国水产科学研究院中央渔业教育研究所（ICAR - Central Institute of Fisheries Education）等机构的研究人员，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “In vitro protein expression profile of cultivated muscle cells from Labeo rohita” 的论文。他们通过对露斯塔野鲮肌肉细胞的研究，成功揭示了其在不同传代过程中的蛋白质表达谱，为理解体外肌肉生成（myogenesis）和培养海鲜发展提供了重要依据。
研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法。首先是细胞培养技术，他们从露斯塔野鲮的肌肉组织获取细胞，进行体外培养和传代。接着是蛋白质组表征技术，通过蛋白质提取、定量和消化，再利用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析，获得蛋白质相关数据。之后使用 MaxQuant 软件对质谱数据进行分析，并通过 metaboanalyst 进行统计分析，还利用了一些在线工具进行通路和蛋白质 - 蛋白质相互作用富集分析 。
下面我们来看看具体的研究结果。
细胞培养
研究人员将露斯塔野鲮的肌肉组织切成小块（1mm3），放入细胞培养瓶中。加入培养基后，肌肉外植体很快就贴附在瓶壁上。120 小时后，细胞开始从外植体向外辐射生长，12 天后完成了第一次传代。之后每 3 天进行一次传代，传代比例为 1:2。在最初的 5 次传代中，细胞在添加 15% 胎牛血清（FBS）的 L - 15 培养基中培养，后续传代时血清浓度降低至 10%。最终，这些肌肉细胞成功传代至 25 代。
露斯塔野鲮肌肉细胞的蛋白质组表征
从第 1 代（T1）、第 15 代（T2）和第 25 代（T3）的露斯塔野鲮肌肉细胞中提取总蛋白质。通过 Bradford 法测定蛋白质浓度，并使用 SDS - PAGE 评估蛋白质质量。经过 MaxQuant 分析，共获得 300 种蛋白质，进一步筛选出含有至少 2 种独特肽段的蛋白质进行后续分析。绘制韦恩图（Venn diagram）展示不同传代间蛋白质的重叠情况，发现第 1 代有 11 种独特蛋白质，第 15 代和第 25 代各有 2 种独特蛋白质 。对 3 个传代进行两两比较，共鉴定出 120 种差异表达蛋白质。通过层次聚类分析（Hierarchical clustering）、火山图（Volcano plot）和条形图（Bar plots）展示了差异表达蛋白质的情况，还利用 STRING 和 Metascape 分别对差异表达蛋白质进行 KEGG 通路和基因本体（Gene Ontology）注释分析 。
讨论
这项研究首次对露斯塔野鲮肌肉细胞系进行了蛋白质组表征。在细胞系开发过程中，外植体培养技术比胰蛋白酶消化法更具优势，能更好地维持细胞状态，减少细胞损伤。L - 15 培养基为细胞生长和增殖提供了良好的环境。
在不同传代的差异表达蛋白质分析中，发现了许多有趣的现象。例如，在 T1 和 T2 之间，血红蛋白亚基 α 样蛋白（hba1）、横纹肌样亚型 X2 和核糖体蛋白 S8（rps8a）表达丰富。hba1 可能为细胞提供氧气，rps8a 则参与生长阶段和蛋白质的生产成熟过程。而核糖体蛋白 L30（rpl30）、载脂蛋白 A - I（apoa1）和碳酸酐酶（cahz）在 T1 代相对 T2 代表达下调，其中 cahz 对维持细胞酸碱平衡至关重要，apoa1 与肌肉内脂肪细胞基因运输有关。
在 T2 和 T3 的比较中，乳酸脱氢酶（ldha）、LIM 结构域结合 3 样蛋白（ldb1a）和 Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子 9（arhgef9a）在 T2 代表达升高。ldha 活性与成肌细胞增殖相关，ldb1a 中的肌肉 LIM 蛋白（MLP）对骨骼肌生成有重要作用，arhgef9a 能控制细胞多种活动。同时，二氢硫辛酰胺脱氢酶（dld）、原肌球蛋白 α - 3 链亚型 X6（tpm3）和 Rho GDP 解离抑制剂 1（arhgdia）在 T2 代表达下调，这些蛋白质与细胞能量生产和肌肉生成密切相关。
T1 和 T3 相比，肌球蛋白结合 H 样蛋白、囊泡融合 ATP 酶（nsfb）和线粒体乌头酸水合酶（aco2）在 T1 代上调，表明早期传代的肌肉细胞可能具有更强的代谢活性和肌原纤维生成能力。而硫氧还蛋白依赖的线粒体过氧化物酶、膜联蛋白（anxa13l）和 ADP - 核糖基化因子（arf1）在 T1 和 T3 组中显著下调，它们在细胞分化和氧化应激反应中发挥着重要作用。
从蛋白质 - 蛋白质相互作用网络来看，不同传代间的蛋白质相互作用存在差异。例如，T1 和 T2 之间的组蛋白 - 赖氨酸 N - 甲基转移酶 SMYD1 样蛋白（smyd1）、磷酸甘油酸变位酶、甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）和烯醇化酶等相互作用，参与了细胞从增殖到分化的转变过程。
在通路富集分析方面，发现糖酵解、代谢和碳代谢通路在肌肉细胞增殖过程中起重要作用，而细胞骨架、核糖体和碳代谢通路则与肌肉细胞分化密切相关。例如，糖酵解相关蛋白在 T1 组中上调，表明早期传代的肌肉细胞可能通过增强糖酵解来满足增殖需求；而细胞骨架蛋白的变化则反映了细胞在分化过程中的形态和功能改变。
综上所述，研究人员成功开发并表征了露斯塔野鲮肌肉细胞系，通过蛋白质组分析揭示了不同传代间 138 种含有至少两种独特肽段的蛋白质，其中 120 种在不同条件下差异表达。这些差异表达蛋白质涉及的糖酵解、代谢、细胞质核糖体和碳代谢等通路，在肌肉细胞生长和分化过程中发挥着关键作用。这一研究成果不仅为理解体外肌肉生成过程提供了深入见解，还为培养海鲜的发展奠定了重要基础，有助于推动细胞培养肉领域的研究进展，未来有望帮助科学家们更好地控制培养肉的品质和生产过程。
