倾斜线扫描照明：解锁活细胞与溶液中蛋白质奥秘的创新之匙

为解决 SMLM 技术中时空分辨率与通量的权衡问题，研究人员开展 OLS 相关研究。结果显示 OLS 能实现高时空分辨率和大视野测量，可研究多种蛋白质动态。推荐阅读，助你了解该技术在细胞生物学研究中的重要价值。

　　

在细胞生物学的微观世界里，蛋白质就像一个个忙碌的小工匠，它们的动态变化对于细胞的正常运作至关重要。蛋白质的功能与它所处的动态局部环境紧密相连，许多蛋白质的相互作用和活动具有瞬态性，就如同一场稍纵即逝的微观舞蹈，要想全面理解蛋白质的功能和机制，就得精准捕捉这些变化在时空上的详细信息。

一直以来，科学家们为了研究蛋白质的运动，尝试了各种各样的成像方法。比如，用不同的成像手段来研究细胞骨架运动蛋白的特性，这些特性对于理解复杂的细胞机制，像纺锤极形成的调控，以及开发有效的治疗方法都有着关键作用。近年来，测量蛋白质动力学还帮助人们明确了膜受体蛋白的活性与运动转变状态之间的联系。

然而，目前的研究方法存在不少难题。以单分子定位显微镜（SMLM）技术中的单分子追踪（SMT）为例，它虽然能在细胞内进行原位测量，但一直被时空分辨率和通量之间的权衡所困扰。打个比方，这就像是在鱼和熊掌之间做艰难抉择，想要高时空分辨率，通量就会受限；追求高通量，时空分辨率又难以保证。像 MINFLUX 技术，虽然能提供高达～1nm 的空间分辨率，揭示其他方法无法获得的精细结构信息，但它天生通量低，无法对大量细胞和蛋白质进行采样，就像用一个小勺子在大海里舀水，能获取的信息非常有限。

此外，传统的通过物镜照明的方案，如高度倾斜和层叠光学片（HILO），虽然容易实施，但存在照明不均匀的问题。这就好比在一个舞台上，有的地方亮如白昼，有的地方却昏暗无光，使得在 SMLM 或 SMT 中，为了减少检测误差和伪影，只能捕捉图像传感器上较小的区域，大大限制了研究的范围。为了改善照明不均匀的状况，人们尝试了多种方法，像全内反射荧光显微镜（TIRF）中的方位光束扫描，但这些方法在提高玻璃 - 样品界面信噪比的同时，对离焦光的抑制效果并不理想，反而影响了整体的信噪比。

在这样的背景下，来自相关研究机构的科研人员决心攻克这些难题。他们在《Nature Methods》期刊上发表了题为 “Oblique line scan illumination enables expansive, accurate and sensitive single-protein measurements in solution and in living cells” 的论文。研究人员发现，通过倾斜线扫描（OLS）这种基于单物镜光片的照明和检测方式，可以实现纳米级空间分辨率和亚毫秒级时间分辨率，并且能在大视野范围内进行测量。这一成果为蛋白质功能的研究开辟了新的道路，有望推动基础研究、药物筛选和系统生物学研究的发展。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建了 OLS 显微镜系统，通过特定的光学元件组合，将激光束整形并聚焦到显微镜物镜的后焦平面，利用振镜扫描形成可扫描的倾斜光片，实现大视野成像；二是采用了 SMT 技术，结合定制的算法对蛋白质分子进行检测、定位和追踪；三是运用了多种数据处理和分析方法，如通过特定的公式计算信噪比（SNR），利用变分贝叶斯混合建模技术从观测轨迹中恢复扩散子群体等。

下面，让我们一起来看看研究人员通过这些技术方法取得了哪些令人惊喜的成果。

均匀照明实现稳健的 SMT

研究人员以表达 Halo - KEAP1 的 U2OS 细胞系为模型，对 OLS 成像系统的性能进行了详细表征。他们用若丹明染料 Janelia Fluorophore 549（JF???）对 Halo - KEAP1 进行稀疏标记，获得了清晰的单分子分辨率数据。通过与同一显微镜上的 HILO 进行对比，OLS 的优势一目了然：在相同时间内，OLS 采集到的轨迹平均数量大幅增加，与计算出的六倍成像视野增加相匹配；在 384 孔板上进行实验时，OLS 的平均信噪比表现更优，标准偏差更小，这意味着它的性能更加稳定可靠。

为了评估 OLS 光学系统照明质量的可重复性，研究人员在四台不同的 OLS 显微镜上进行了并排的 SMT 测量。他们使用 Halo - KEAP1 U2OS 细胞系和 KI - 696（一种能破坏 KEAP1 与其结合伙伴 NRF2 相互作用的小分子抑制剂）进行实验，结果发现四台显微镜的平均剂量 - 反应曲线一致，且平均视野水平的信噪比也相近，这充分证明了 OLS 系统的稳健性和可重复性。

由于 OLS 中每个荧光团的光照时间更短，研究人员推测它能减少运动引起的模糊，从而获得更一致的点扩展函数（PSF）。实验结果证实了这一推测，与 HILO 相比，OLS 照明下 Halo - KEAP1 的平均 2σ 半径增加幅度更小，而且在高标记密度下，OLS 能更好地跟踪单粒子，展现出更高的分辨率性能。

此外，研究人员还研究了帧速率对实验的影响。通过光学 - 动力学模拟和实验验证，他们发现随着帧速率的提高，平均轨迹长度和跟踪保真度都有所改善，虽然采样视野大小会有所妥协，但整体上更有利于准确测量细胞环境中的快速蛋白质扩散。对于 Halo - KEAP1 来说，400Hz 似乎是一个合适的采样速度，但研究人员也指出，活细胞中可能存在需要更高帧速率的生化过程，因此 OLS 可调节的采样速度是其一大优势。

OLS 可捕捉单蛋白动力学的异质性

蛋白质在细胞内的运动存在异质性，就像不同的人在一个大房间里有着不同的活动轨迹一样。研究人员以 VCP 蛋白为例，利用 OLS 来探究这种异质性。VCP 蛋白具有多种细胞功能，与关键辅因子的结合会因细胞内位置不同而变化。研究人员通过基于强度的分割模型，在同一视野中同时捕捉 VCP 蛋白在细胞核、核周和细胞质区域的轨迹。

在基线条件下，他们发现 VCP 蛋白在远离细胞核和核周区域时运动性更强，这表明这些区域中内质网（ER）和细胞核定位的 VCP 可能更多地参与蛋白质的隔离和降解过程。当用小分子抑制剂 CB - 5083 处理细胞后，VCP - Halo 在所有三个区域的扩散系数都显著下降，这说明抑制 VCP 的酶活性会影响其在底物丰富区域的局部驻留时间。

研究人员还通过 siRNA 敲低 VCP 的一个辅因子 FAF2，进一步展示了 OLS 系统捕捉蛋白动力学变化的能力。敲低 FAF2 后，核周区域 VCP 的扩散系数增加，而细胞核和细胞质中的 VCP 动力学变化较小，这证实了 VCP 与 FAF2 的结合主要发生在内质网。

在单细胞分析方面，研究人员以 PCNA 蛋白为例，研究了细胞周期对蛋白质动力学的影响。他们将 Halo - PCNA 引入 U2OS 细胞系，通过机器学习模型对细胞周期进行分类，并使用不同浓度的 JF???和 JFX???对细胞进行标记，同时进行细胞周期分配和 SMT 测量。结果发现，PCNA 蛋白在 S 期的运动速度较慢，这与它在 DNA 复制位点的富集有关；在 G1、G2 和 M 期，PCNA 蛋白的动力学明显增加，且在整个细胞核中均匀分布。这些结果不仅与之前对 PCNA 动力学的研究一致，而且展示了 OLS 系统在单细胞分析中的优势，能够快速自动地捕捉和分析数千个细胞，比传统手动 SMT 方法更高效。

OLS 能够测量溶液中的蛋白质扩散

凭借 OLS 更高的帧速率和卓越的光学切片性能，研究人员尝试用它来测量溶液中纯化蛋白质的扩散特性。他们首先测量了 JF???标记的 His - Halo 在不同甘油浓度下的扩散系数，通过跟踪结果进行估计并校正偏差，发现实验值与斯托克斯 - 爱因斯坦方程预测的理论值非常吻合，这表明 OLS 能够准确测量溶液中蛋白质的扩散。

接着，研究人员以转录因子 4（TCF4）和 β - 连环蛋白（β - catenin）的相互作用为例，监测了 JF???标记的 TCF4 在不同浓度 β - catenin 存在下的扩散情况。他们发现，随着 β - catenin 浓度的增加，TCF4 的扩散系数降低，而且二价 β - catenin 比单价 β - catenin 对 TCF4 扩散的影响更大，这符合较大有效粒径的粒子扩散较慢的预期。此外，添加未标记的 TCF4 或小分子抑制剂毒黄素（toxoflavin）能够竞争 β - catenin 与 TCF4 的结合，使 TCF4 的扩散系数增加，这表明溶液中的 SMT（isSMT）可以作为一种新的生物物理方法来监测蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs）和蛋白质 - 配体相互作用，并且具有潜在的皮摩尔级灵敏度，在药物发现领域有着广阔的应用前景。

OLS 适用于多种 SMLM 技术

OLS 系统的均匀照明、高时空分辨率、成像速度和稳健性使其在多种生物显微镜技术中具有广泛优势。研究人员通过对 JF???和 JF???共标记的 Halo - KEAP1 进行成像，展示了 OLS 在双色 SMT 中的应用能力。尽管在远红光谱中 sCMOS 的量子效率下降导致信噪比降低，但他们仍然能够使用红移的 JF???捕获 SMT 数据，并且得到的 EC??值与更亮的 JF???染料一致，这说明 OLS - 基于的 SMT 在多色成像和低量子产率荧光团成像方面具有应用潜力。

在固定细胞的 STORM 成像实验中，研究人员用抗微管蛋白一抗和 Alexa Fluor 647（AF647）或 CF568 标记的二抗对细胞进行标记，在 ×60 的全视野下进行成像。结果显示，即使 OLS 的积分时间仅为 400μs，自发的光开关现象也能提供足够的光子，使 AF647 和 CF568 的横向定位精度达到约 15nm，这表明 OLS 能够实现高速、高通量的表型筛选。

研究人员还利用 OLS 的线扫描组件，对 KI - 696 处理的 Halo - KEAP1 细胞进行了相关的 SMT - 荧光漂白恢复（FRAP）实验。他们通过漂白特定区域，然后测量漂白区域和未漂白区域的蛋白质动力学变化，结果发现 KI - 696 增加了 Halo - KEAP1 的蛋白质动力学，并且在不同染料浓度下都能得到一致的结果，这进一步证实了 OLS 在敏感的单分子检测和 SMT 方面的优势，即使在标记稀疏度未优化的情况下也能有效工作。

总的来说，OLS 作为一种新的照明方案，极大地提升了基于 SMLM 和 SMT 的技术性能。与以往的照明方法相比，它具有大而均匀照明的视野、更好的切片能力、更高的信噪比和高时空分辨率。OLS 能够在多种细胞系统和蛋白质靶点上进行 SMT，为研究蛋白质功能提供了更强大的工具。

通过对 VCP 和 PCNA 等蛋白质的研究，OLS 展示了其捕捉蛋白质动力学空间依赖性变化和单细胞异质性的能力，这对于深入理解蛋白质的功能和细胞生物学机制至关重要。同时，OLS 还使在溶液中直接研究蛋白质动力学成为可能，为药物发现提供了新的方法和思路。此外，OLS 在多种 SMLM 技术中的成功应用，如双色 SMT、STORM 和 FRAP，表明它具有广泛的适用性，有望推动高分辨率、快速成像的显微镜研究取得更大进展。

虽然目前 OLS 在成像速度和视野大小之间还存在一定的权衡，并且大数据集的数据存储和处理也面临挑战，但随着技术的不断发展和完善，这些问题有望得到解决。可以预见，OLS 将在系统生物学研究和药物筛选等领域发挥越来越重要的作用，为生命科学的发展带来更多惊喜。