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为解决现有成像技术研究细胞内蛋白质运动的局限，相关研究人员开展 OLS 技术用于蛋白质研究的主题研究。结果显示 OLS 能实现大视野、高分辨成像。推荐阅读，助您了解其在生物研究中的创新价值与应用潜力。
在细胞生物学的微观世界里，蛋白质就像一个个忙碌的小工匠，它们的一举一动都对细胞的正常运作至关重要。蛋白质的功能与它所处的动态局部环境密切相关，许多蛋白质的相互作用和活动转瞬即逝，想要全面了解蛋白质的功能和作用机制，就得像给它们拍 “特写电影” 一样，捕捉详细的时空信息。比如说，细胞骨架马达等机械蛋白的运动，一直是科学家们关注的焦点，研究它们的运动特性，有助于理解复杂的细胞机制，甚至能为开发有效的治疗方法提供线索。还有转录复合物起始过程，其高度动态和瞬态的特点，也需要通过测量蛋白质的运动和在染色质上的停留时间来深入探究。此外，蛋白质动力学的测量还能揭示膜受体蛋白的活性与运动转变状态之间的联系。
然而，想要给细胞内的蛋白质拍这样一部 “特写电影” 可不容易。目前的成像方法虽然在细胞生物学的某些领域发挥了作用，但在测量细胞环境中蛋白质运动方面，却存在不少难题。就拿 MINFLUX 技术来说，它虽然能提供高达～1 纳米的空间分辨率，就像拥有一台超级显微镜，能看到其他方法看不到的精细结构信息，但它的通量很低，就像一个慢吞吞的摄影师，没办法对大量的细胞和蛋白质进行采样。而单分子追踪（SMT）技术呢，它需要足够的时间采样，才能通过计算将不同帧的信息连接起来，生成轨迹，从而计算出扩散系数等动态属性。虽然高灵敏度的 sCMOS 和 EMCCD 相机、频闪照明以及更好的标记策略等技术的出现，让 SMT 能够测量细胞内快速和瞬态的过程，但这些先进显微镜技术的照明方式又存在问题，比如通量低、照明不均匀，还容易受到仪器和用户操作的影响。传统的通过物镜照明的方案，像高度倾斜和层叠光学片（HILO），虽然容易操作，只需要一个高数值孔径（NA）的物镜就行，但它的照明不均匀，在用于单分子定位显微镜（SMLM）或 SMT 时，为了减少检测误差和伪影，只能捕捉图像传感器上较小的区域。各种改进照明不均匀的方法，也都存在一些弊端，有的虽然能提高玻璃 - 样品界面的信噪比（SNR），但在排除离焦光方面却效果不佳，反而影响了整体的信噪比。
为了解决这些难题，来自相关研究团队的研究人员在《Nature Methods》期刊上发表了题为 “Oblique line scan illumination enables expansive, accurate and sensitive single-protein measurements in solution and in living cells” 的论文。他们发现，倾斜线扫描（OLS）这种基于光片的照明策略，就像是为细胞内蛋白质拍摄 “特写电影” 的得力助手。OLS 能够在 384 孔板中实现比 HILO 大六倍（250×190μm2）的视野（FOV）捕获，还具备纳米级的空间分辨率和亚毫秒级的时间分辨率。而且，OLS 的光学配置相对简单，在配备水浸或油浸高 NA 物镜以及具有光片模式功能的 sCMOS 相机的倒置显微镜上就能轻松实现。这一发现为在活细胞和植物细胞中更深入地理解蛋白质功能奠定了基础，为利用这些测量获得的新机制见解开辟了道路。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：
- OLS 显微镜技术：这是一种定制的显微镜技术，通过特定的光学配置，将薄光学光片聚焦到显微镜物镜的后焦平面，并利用振镜进行扫描，从而实现大视野、高分辨率的成像。
- SMT 软件及相关算法：利用定制的软件和算法对 SMT 数据进行处理，包括检测单个发射器、将其定位到亚像素精度，以及通过改进的算法将定位的发射器在时间上连接起来生成轨迹。
- 多种数据分析方法：运用如计算平均扩散系数、通过状态阵列分析解析多动态状态轨迹、进行偏差估计等方法，对实验数据进行深入分析。
下面，让我们一起来看看研究人员通过这些技术方法都得到了哪些有趣的结果吧。
- 均匀照明实现稳健的 SMT：研究人员为了扩大有效成像面积，同时在图像传感器上实现均匀的信噪比，开发了 OLS 技术。他们以表达 Halo - KEAP1 的 U2OS 细胞系为模型，对 OLS 成像系统的性能进行了测试。结果发现，与 HILO 相比，OLS 视野内平均轨迹数量从 25,765（±4,838 s.d.）增加到了 167,479（±46,324 s.d.），与计算出的六倍成像视野增加相匹配。而且，OLS 的信噪比更稳定，性能更优。研究人员还在四台不同的 OLS 显微镜上进行了并排的 SMT 测量，发现不同显微镜的测量结果具有良好的一致性，这表明 OLS 系统具有很强的稳健性和可重复性。此外，由于 OLS 的照明时间更短，能有效减少运动模糊，在跟踪高密度的单个粒子时，具有更好的分辨能力。研究人员还研究了更高帧率采集对检测窗口和关键成像指标的影响，发现帧率的提高有助于更准确地测量细胞环境中快速蛋白质的扩散，400Hz 的帧率似乎是测量 Halo - KEAP1 扩散的合适采样速度，但他们预计活细胞中可能存在需要更高帧率的生化过程，这也凸显了 OLS 可调节采样速度的优势。
- OLS 可捕捉单蛋白动态的异质性：蛋白质在细胞内的运动存在异质性，为了探究 OLS 是否能够捕捉到这种异质性，研究人员以 VCP 蛋白为例进行了研究。VCP 蛋白参与多种细胞功能，通过与关键辅助因子的结合来发挥作用。研究人员利用基于强度的分割模型，在同一视野中捕获 VCP 蛋白在细胞核、核周和细胞质中的轨迹。结果发现，在基线条件下，远离细胞核和核周区域的 VCP 蛋白移动性更强，这表明这些区域的内质网和细胞核定位的 VCP 蛋白大多参与蛋白质的隔离和降解过程。当用小分子抑制剂 CB - 5083 处理细胞后，VCP - Halo 的扩散系数在所有三个区域都显著下降，这说明抑制 VCP 的酶活性可能会影响其在底物丰富区域的局部停留时间。研究人员还通过 siRNA 敲低 VCP 的一个辅助因子 FAF2，发现核周区域的 VCP 扩散系数增加，而细胞核和细胞质中的 VCP 动力学变化较小，这进一步证实了 VCP 与 FAF2 的结合大多发生在内质网。此外，研究人员还发现细胞间的异质性是 SMT 测量中最大的变异来源，于是他们以 PCNA 蛋白为例，研究了细胞周期对蛋白质动力学的影响。他们通过机器学习模型预测细胞周期阶段，发现 PCNA 蛋白在 S 期的动力学较慢，这与它在 DNA 复制位点的富集有关，而在 G1、G2 和 M 期，PCNA 蛋白的动力学则明显增加，这与它在细胞核中的均匀分布相对应。这些结果表明，OLS 技术能够捕捉和阐明细胞水平上蛋白质动力学的异质性。
- OLS 实现溶液中蛋白质扩散的测量：由于 OLS 具有更高的帧率和更好的光学切片性能，研究人员想测试它是否适合测量溶液中纯化蛋白质的扩散特性。他们先测量了 JF???标记的 His - Halo 在不同甘油浓度下的扩散系数，结果发现测量值与斯托克斯 - 爱因斯坦方程预测的理论值非常接近。接着，他们研究了蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs）对扩散的影响。以转录因子 4（TCF4）和 β - 连环蛋白（β - catenin）为例，他们发现随着 β - catenin 浓度的增加，TCF4 的扩散会受到抑制，而且二价 β - catenin 比单价 β - catenin 对 TCF4 扩散的抑制作用更强。此外，他们还通过添加未标记的 TCF4 或小分子抑制剂，证明了可以竞争掉 TCF4 与 β - catenin 的相互作用，从而增加 TCF4 的扩散。这些结果表明，溶液中的 SMT（isSMT）是一种监测 PPIs 和蛋白质 - 配体相互作用的新生物物理方法，具有潜在的皮摩尔级灵敏度，在药物发现领域可能有重要应用。
- OLS 适用于多种 SMLM 技术：OLS 系统的均匀照明、高时空分辨率、成像速度和稳健性，使其在多种生物显微镜技术中具有广泛的优势。研究人员通过捕获 JF???和 JF???标记的 Halo - KEAP1 的时间序列，证明了 OLS - 基于的 SMT 在多色成像中的应用潜力，即使在远红光谱中 sCMOS 量子效率下降导致信噪比降低的情况下，仍能获得可靠的测量结果。他们还在固定细胞中进行了 STORM 成像，发现尽管 OLS 的积分时间很短，但自发的光开关现象提供了足够的光子，使 AF647 或 CF568 标记的微管能够实现约 15 纳米的横向定位精度，这表明 OLS 照明有望用于高速、高通量的表型筛选。此外，研究人员利用 OLS 的线扫描组件，对 KI - 696 处理的 Halo - KEAP1 细胞进行了相关的 SMT - 荧光恢复后光漂白（FRAP）实验，结果与之前的 SMT 测量结果一致，表明 KI - 696 增加了 Halo - KEAP1 蛋白的动力学，这也证明了 OLS 在低标记稀疏度下仍能实现灵敏的斑点检测和 SMT。
在研究结论和讨论部分，研究人员总结了 OLS 作为一种新的照明方案，在增强 SMLM 和 SMT 技术方面的诸多优势。与之前的照明方法相比，OLS 提供了更大、更均匀的照明视野、更好的切片能力、更高的信噪比和高时空分辨率。OLS 能够在不降低信噪比和跟踪保真度的情况下，实现高达 1,250Hz 的帧率数据采集，这为研究以前用其他 SMT 照明方法无法测量的快速蛋白质运动提供了机会，有助于揭示可能发生在亚毫秒级别的新蛋白质和细胞机制。不过，目前 OLS 的成像速度是以牺牲视野大小为代价的，未来需要进一步研究优化硬件解决方案，比如使用速度更快的相机来缓解这一问题。通过对 VCP 等蛋白质的研究，研究人员展示了 OLS 捕捉蛋白质扩散系数微小但显著的空间依赖性变化的能力，这有助于更细致地了解蛋白质辅助因子的普遍性和重要性。此外，OLS 的大视野能够同时捕获大量细胞，从而研究细胞间的异质性，这在研究 PCNA 蛋白动力学与细胞周期关系的实验中得到了很好的体现。而且，OLS 还能直接用于研究溶液中的蛋白质动力学，验证了 isSMT 测量与理论的一致性，并展示了其在监测蛋白质相互作用和药物发现方面的潜力。研究人员还强调，尽管 OLS 生成的大量数据集在数据存储和处理方面可能存在挑战，但随着表型成像在系统生物学研究和药物筛选中的重要性日益增加，像 OLS 这样的先进显微镜技术的需求也会不断增加。
总的来说，OLS 技术为细胞生物学研究带来了新的曙光，它就像一把万能钥匙，打开了许多之前难以探索的微观世界的大门，让科学家们能够更深入地了解蛋白质的奥秘，为基础研究、药物筛选和系统生物学研究提供了强有力的工具，有望推动相关领域取得更多突破性的进展。
