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为探究 HCMV 的 UL82 影响 CRC 患者预后的机制，温州医科大学研究人员开展相关研究。结果发现 UL82 通过上调 AGR2 促进 CRC 细胞增殖与核苷酸代谢。该研究为理解 HCMV 与 CRC 关系提供新视角，值得科研读者一读。
在医学研究的广阔领域中，结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）就像一个顽固的 “敌人”，严重威胁着人类的健康。它是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。近年来，人们逐渐发现肿瘤组织中的持续性病毒感染与癌症预后之间存在着千丝万缕的联系，而人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）就是其中一个备受关注的 “角色”。
HCMV 是一种广泛流行的疱疹病毒，全球大约 40%-95% 的人都感染过它。令人惊讶的是，在多种肿瘤中都能检测到 HCMV 及其表达产物，结直肠癌就是其中之一，大约 21% 的直肠癌和 18% 的结肠癌检测出 HCMV 阳性。更奇怪的是，HCMV 感染通常只局限于肿瘤组织，在正常组织中很少能检测到。临床数据显示，HCMV 感染与患者的不良预后有关，但它在结直肠癌发生和发展过程中究竟扮演着怎样的角色，一直是个未解之谜。
温州医科大学附属第二医院和育英儿童医院临床检验部等单位的研究人员为了揭开这个谜团，在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Human cytomegalovirus UL82 promotes cell cycle progression of colorectal cancer by upregulating AGR2” 的论文。他们发现，HCMV 的被膜蛋白 UL82 与宿主转录因子 DDX5 相互作用，导致癌基因 AGR2 上调，进而促进了结直肠癌细胞的核苷酸代谢和细胞增殖 。这一发现为理解 HCMV 与结直肠癌之间的关系提供了新的视角，也为 HCMV 感染的结直肠癌患者的治疗提供了潜在的干预靶点。
为了开展这项研究，研究人员运用了多种技术方法。他们通过 RNA 测序来分析基因表达的变化，以此找出与 UL82 相关的差异表达基因；利用免疫沉淀 - 质谱（IP-MS）技术来寻找与 UL82 相互作用的蛋白质；借助染色质免疫沉淀（ChIP）实验确定转录因子与基因启动子的结合情况；运用代谢组学分析来研究细胞代谢物的变化；还构建了裸鼠异种移植模型，在动物体内观察肿瘤的生长情况 。这些技术方法就像是研究人员手中的 “秘密武器”，帮助他们一步步揭开了 HCMV 与结直肠癌之间的神秘面纱。
UL82 促进 CRC 细胞增殖
研究人员首先想知道 UL82 在结直肠癌进展中到底起什么作用。他们把含有 UL82 表达质粒的载体导入结直肠癌细胞系 SW620 和 HCT116 中，构建了 UL82 过表达细胞模型 SW620 - UL82OE 和 HCT116 - UL82OE。通过 qPCR 和蛋白质免疫印迹（western blot）分析，确认了 UL82 在这些细胞模型中的表达明显增加。
接下来，他们用 CCK8 实验来检测细胞的增殖能力。结果发现，UL82 就像给癌细胞打了一针 “兴奋剂”，显著增强了细胞的增殖能力。集落形成实验也表明，UL82 能让 SW620 和 HCT116 细胞形成更多的集落。流式细胞术分析显示，UL82 加速了细胞周期的进程，尤其是让处于 S 期的细胞比例明显增加。进一步研究细胞周期相关蛋白发现，UL82 上调了 c - Myc、细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白 E1（cyclin E1）的表达，这说明 UL82 是通过调节细胞周期来促进结直肠癌细胞增殖的。
为了在体内验证这一结果，研究人员把转染了 UL82 或载体的 SW620 细胞注射到裸鼠的侧腹。定期监测发现，转染 UL82 的肿瘤生长速度更快，体积也明显比对照组大，这就像在动物体内也证实了 UL82 是癌细胞的 “帮凶”。
UL82 增强 CRC 细胞中 AGR2 的表达
为了弄清楚 UL82 促进结直肠癌细胞增殖的分子机制，研究人员对过表达 UL82 的 SW620 细胞（SW620 - UL82OE）进行了转录组测序。根据设定的筛选标准，他们发现有 46 个基因上调，13 个基因下调。进一步分析上调基因发现，AGR2、GZMB 和 SYTL5 在数据库中的结直肠癌标本中也显著上调。通过 qPCR 验证，发现 UL82 能上调 AGR2 和 SYTL5 的表达，但对 GZMB 没有影响。考虑到 GZMB 是一种具有抗肿瘤免疫作用的分子，与结直肠癌进展呈负相关，研究人员就把它排除在外了。
为了进一步明确 HCMV 感染后 UL82 对细胞转录的调控作用，研究人员在体外模拟 HCMV 感染结直肠癌细胞的过程。他们用紫外线灭活的 HCMV（InHCMV）和活性 HCMV 感染 SW620 细胞，qPCR 分析发现，感染后只有 AGR2 的表达上调，而 SYTL5 的表达下降，这表明 AGR2 是 HCMV 感染后影响结直肠癌细胞预后的关键下游分子。蛋白质免疫印迹分析进一步证实，UL82 和 HCMV 感染都能上调 SW620 细胞中 AGR2 的表达。对裸鼠肿瘤组织的免疫组化（IHC）分析以及对结直肠癌患者肿瘤组织的 IHC 分析都显示，UL82 过表达组或 HCMV 阳性的结直肠癌肿瘤组织中 AGR2 的水平明显更高，这说明 UL82 可能是通过上调 AGR2 的表达来促进结直肠癌细胞增殖的。
AGR2 促进 CRC 细胞周期进展和细胞增殖
AGR2 在多种肿瘤的发生发展中都发挥着作用，但它在结直肠癌细胞增殖中的作用还不清楚。研究人员先检测了 7 种结直肠癌细胞系中 AGR2 的表达水平，发现 SW620、HCT116、RKO 和 SW480 细胞中没有 AGR2 表达，LS174T 和 GP2D 细胞中 AGR2 表达较高，HT29 细胞中表达适中。
于是，他们选择在 SW620 和 HCT116 细胞中过表达 AGR2，在 GP2D 和 LS174T 细胞中敲低 AGR2，来研究 AGR2 对结直肠癌细胞增殖的影响。qPCR 和蛋白质免疫印迹分析表明，过表达 AGR2 后，SW620 和 HCT116 细胞中 AGR2 的 mRNA 和蛋白质水平显著升高；敲低 AGR2 后，GP2D 和 LS174T 细胞中 AGR2 的 mRNA 和蛋白质水平明显下降。
CCK8 实验显示，过表达 AGR2 能显著促进 SW620 和 HCT116 细胞的生长，而敲低 AGR2 则会使 GP2D 和 LS174T 细胞的生长明显减缓。集落形成实验也表明，过表达 AGR2 增加了 SW620 和 HCT116 细胞的集落形成能力，敲低 AGR2 则降低了 GP2D 和 LS174T 细胞的集落形成能力。流式细胞术分析发现，过表达 AGR2 促进了 SW620 和 HCT116 细胞的细胞周期进展，使 S 期细胞比例增加；敲低 AGR2 则导致细胞周期在 S 期停滞，S 期细胞比例显著下降。蛋白质免疫印迹分析还发现，过表达 AGR2 上调了 c - Myc、cyclin D1 和 cyclin E1 的表达，敲低 AGR2 则下调了这些蛋白质的表达，这说明 AGR2 在促进结直肠癌细胞周期进展中起着关键作用。
UL82 通过 AGR2 促进 CRC 细胞生长和细胞周期进展
为了确定 UL82 是否通过调节 AGR2 的表达来影响结直肠癌细胞的增殖，研究人员进行了一系列互补实验。他们在之前构建的 SW620 - UL82OE 和 HCT116 - UL82OE 细胞模型中敲低 AGR2，qPCR 和蛋白质免疫印迹分析证实了 AGR2 被有效敲低。
CCK8 和集落形成实验表明，敲低 AGR2 后，细胞的增殖能力和集落形成率显著下降，这意味着 AGR2 敲低可以逆转 UL82 对 SW620 和 HCT116 细胞的促增殖作用。流式细胞术分析显示，敲低 AGR2 导致细胞周期停滞，S 期细胞比例明显减少，说明 AGR2 敲低能逆转 UL82 对细胞周期进展的影响。蛋白质免疫印迹分析也发现，敲低 AGR2 后，SW620 - UL82OE 和 HCT116 - UL82OE 细胞中 c - Myc、cyclin D1 和 cyclin E1 的表达水平下降。
在体内实验中，研究人员将敲低 AGR2 和对照敲低的 SW620 - UL82OE 细胞注射到裸鼠侧腹，结果发现敲低 AGR2 组的肿瘤生长明显更慢，体积也更小，这进一步证明了 UL82 是通过上调 AGR2 来促进结直肠癌细胞增殖的。
DDX5 与 UL82 相互作用并转录抑制 AGR2 表达
UL82 可以通过与宿主转录因子结合来影响宿主细胞的表达模式，研究人员猜测它可能通过与调节 AGR2 表达的转录因子相互作用来影响 AGR2 的表达。通过 IP - MS 技术，他们在 SW620 细胞中发现了 47 种与 UL82 结合的蛋白质，包括 DDX5、PHOX2B、H1 - 3 和 PKMYT1 等。
利用转录因子预测数据库 Human TFDB，研究人员预测了可能与 AGR2 基因启动子区域结合的蛋白质，再与 IP - MS 结果交叉分析，确定了 DDX5 和 PHOX2B 为候选转录因子。转录组数据显示，DDX5 和 PHOX2B 与 AGR2 的表达呈显著负相关。但双荧光素酶报告基因实验表明，在 HEK293T 细胞中过表达 PHOX2B 并不影响 AGR2 启动子的活性，所以研究人员把重点放在了 DDX5 上。
共免疫沉淀（Co - IP）和免疫荧光共定位结果显示，DDX5 与 UL82 相互作用，并在细胞核中共定位。双荧光素酶报告基因实验还表明，过表达 DDX5 显著抑制 AGR2 启动子的活性，而过表达 UL82 则显著增强 AGR2 启动子的活性。当同时转染 UL82 和 DDX5 时，AGR2 启动子的活性比单独转染 DDX5 时更高，这说明 UL82 与 DDX5 的相互作用可能减轻了 DDX5 对 AGR2 启动子的转录抑制作用。
用 DDX5 抑制剂 FL118 处理 SW620 和 HCT116 细胞后，AGR2 的 mRNA 和蛋白质水平上调，进一步证实了 DDX5 是 AGR2 的负转录调节因子。ChIP 实验也表明，DDX5 能结合到 AGR2 的启动子区域，而 UL82 过表达不影响 DDX5 的蛋白质水平，这意味着 UL82 可能通过与 DDX5 相互作用，阻断其对 AGR2 的转录抑制，从而促进 AGR2 的表达。
UL82 - AGR2 轴促进 CRC 细胞中的核苷酸代谢
为了阐明 UL82 - AGR2 轴调节结直肠癌细胞周期和增殖的机制，研究人员对 SW620 - UL82OE 和载体对照细胞进行了代谢组学分析。代谢物差异分析发现，有 51 种代谢物上调，29 种代谢物下调，这些差异代谢物主要富集在嘌呤和嘧啶代谢途径中，涉及尿嘧啶、鸟苷、CMP、dAMP、AMP 等。这表明 UL82 对结直肠癌细胞的核苷酸代谢有显著影响。
之前的研究发现，UL82 - AGR2 轴主要影响细胞周期的 S 期，而肿瘤细胞在 S 期需要合成大量的 dNTP 来满足 DNA 复制的需求。因此，研究人员推测 UL82 - AGR2 轴可能通过调节核苷酸代谢酶的水平来影响 dNTP 的合成，进而影响结直肠癌细胞的增殖。
他们对敲低 AGR2 的 SW620 - UL82OE 细胞进行转录组测序，差异分析发现有 1751 个基因下调，这些基因主要富集在细胞周期和 DNA 复制途径中。通过与 KEGG 数据库中核苷酸代谢酶的交叉分析，确定了 9 种受 UL82 - AGR2 轴调节的核苷酸代谢酶。基于 GEPIA 数据库，他们选择了结直肠癌中上调的酶进行进一步研究，包括 DTYMK、RRM2、TYMS、TK1 和 ENTPD2 等。qPCR 和蛋白质免疫印迹分析证实，DTYMK、RRM2 和 TYMS 的表达水平受 UL82 - AGR2 轴的调节，这表明 UL82 - AGR2 轴可能通过增强结直肠癌细胞的核苷酸代谢，促进 DNA 复制，从而促进结直肠癌细胞的增殖。
在这项研究中，研究人员发现 HCMV 的被膜蛋白 UL82 与宿主转录因子 DDX5 相互作用，解除了 DDX5 对癌基因 AGR2 的转录抑制，使 AGR2 表达上调。上调的 AGR2 促进了结直肠癌细胞的细胞周期进展和增殖，同时 UL82 - AGR2 轴还增强了结直肠癌细胞的核苷酸代谢，为癌细胞的快速增殖提供了物质基础 。
这一研究成果意义重大，它揭示了 HCMV 感染导致结直肠癌患者预后不良的潜在机制，让人们对 HCMV 与结直肠癌之间的关系有了更深入的认识。同时，研究结果表明 UL82 有可能成为 HCMV 感染的结直肠癌患者治疗的潜在靶点，为开发新的治疗方法提供了理论依据。不过，研究也存在一些局限性，比如虽然鉴定出了与 UL82 相互作用的 47 种蛋白质，但并没有完全剖析这些蛋白质在结直肠癌进展中的作用。未来，研究人员可以进一步聚焦这些相互作用蛋白在结直肠癌中的功能，尤其是它们对癌细胞能量代谢的影响，从更多角度深入探索 HCMV 与结直肠癌之间的关系，为攻克结直肠癌这一难题提供更多的思路和方法。
