钙信号调控下的人多能干细胞标准化培养体系建立及其在维持干细胞多能性中的作用机制研究

本研究针对人多能干细胞(hPSC)培养中存在的批次间变异和未明确培养条件导致的异质性问题，通过比较100余株iPSC和ESC在明确与未明确培养条件下的基因表达谱，发现明确培养条件可显著降低细胞间变异性，并揭示钙离子(Ca2+)信号通路在维持干细胞多能性中的关键作用。研究为hPSC的标准化培养提供了重要理论依据，对推进干细胞临床应用具有重要意义。

　　

干细胞研究领域长期面临着一个关键挑战：如何在实验室条件下稳定维持人多能干细胞(hPSC)的多能性状态。尽管诱导多能干细胞(iPSC)技术获得了2012年诺贝尔奖，但实际应用中仍存在显著障碍——不同实验室甚至同一实验室内，干细胞系之间表现出令人困扰的批次间变异。这种变异主要源于两个因素：未明确培养条件的使用（如含胎牛血清的培养基、鼠源饲养层细胞）和重编程过程本身带来的表观遗传记忆。这些问题严重制约了iPSC在疾病建模和细胞治疗中的广泛应用。

Karolinska Institutet的研究团队在《Communications Biology》发表的研究中，系统分析了十余年间积累的100多株iPSC和胚胎干细胞(ESC)的基因表达数据。研究采用Illumina基因表达芯片技术，结合PluriTest多能性评估、蛋白质互作网络分析和活细胞钙成像等关键技术，对明确培养条件（使用层粘连蛋白521基质和Essential 8培养基）与未明确培养条件下的干细胞特性进行了全面比较。

研究首先通过主成分分析(PCA)揭示了培养条件对干细胞异质性的决定性影响。结果显示，明确培养条件下的干细胞呈现出显著更高的同质性，其基因表达谱与未明确培养条件下的干细胞形成明显区分。值得注意的是，当将未明确条件下培养的干细胞转移到明确培养体系后，其基因表达特征迅速向原生明确培养的干细胞靠拢，表明培养条件而非细胞来源是决定异质性的主要因素。

差异基因表达分析鉴定出313个在明确与未明确培养条件间差异表达的基因。这些基因显著富集于多能性调控、TGF-β信号和细胞黏附等通路。特别引人注目的是，明确培养条件下的干细胞表现出核心多能性因子NANOG的上调，同时三胚层分化标志物（如AFP、HAND1、DLX5等）的表达普遍下调，提示明确培养条件更有利于维持干细胞未分化状态。

蛋白质互作网络分析进一步揭示，差异表达基因在蛋白水平上形成了高度互联的网络。其中，下调基因主要参与细胞分化相关通路，而上调基因则显著富集于钙离子结合功能。这一发现将研究引向了一个新颖的方向——钙信号在维持干细胞多能性中的潜在作用。

通过精心设计的实验，研究人员证实钙信号确实与干细胞多能性密切相关。当使用不含TGFβ和bFGF的E6培养基诱导干细胞分化时，伴随着多能性标志物的下降，钙振荡的频率和幅度显著降低。反之，使用SERCA泵抑制剂Thapsigargin短暂抑制细胞内钙活性，即足以导致POU5F1、NANOG等核心多能性因子表达的快速下调，这直接证明了钙信号对维持多能性的必要性。

研究还发现，明确培养条件下的干细胞对细胞间通讯的依赖性更强。间隙连接阻滞剂辛醇-1处理可显著影响干细胞的钙活动模式，而在分化中的干细胞中这一效应更为明显，提示细胞间通讯在维持干细胞特性中的重要性可能随分化状态而变化。

这项研究的重要价值在于：首次系统证明了明确培养条件可显著降低干细胞系的异质性，为建立标准化培养方案提供了理论依据；揭示了钙信号通路在维持干细胞多能性中的新机制，为优化培养体系提供了新靶点；研究结果对推进干细胞在再生医学和疾病建模中的应用具有重要指导意义。特别值得注意的是，研究发现将现有未明确条件下培养的干细胞转移到明确培养体系即可显著改善其均一性，这一发现对实验室现有干细胞资源的优化利用具有直接参考价值。

研究的局限性在于尚未阐明明确培养条件影响钙信号的具体分子机制，以及这些变化如何最终调控多能性基因网络。未来研究可进一步探索钙结合蛋白如CALML4、AIF1等在干细胞自我更新中的具体功能，并开发基于钙信号调控的新型培养策略。这些工作将有助于推动干细胞技术向更标准化、更可控的方向发展，加速其临床转化进程。