突破！HPLC 法精准定量左旋多巴与卡比多巴，助力帕金森病治疗新突破及绿色分析

为解决现有左旋多巴（LD）和卡比多巴（CD）分析方法的不足及治疗方案的缺陷，澳大利亚南澳大学研究人员开发 HPLC 法测定其含量。该方法准确、绿色，能助力长效注射剂研发，推荐科研读者阅读。

　　

在全球，帕金森病就像一个 “沉默的杀手”，无情地影响着超过 1000 万人的生活。这是一种神经系统疾病，随着病情发展，患者的日常活动会变得困难重重，连简单的动作都难以完成。目前，多巴胺替代疗法是主要的治疗方案，而左旋多巴（Levodopa，LD）和卡比多巴（Carbidopa，CD）的组合是一线治疗药物。

左旋多巴是多巴胺的前体药物，自 1967 年被发现以来，一直是治疗帕金森病的 “黄金标准”。不过，它有个 “小麻烦”，口服后会在血浆中迅速脱羧变成多巴胺，刺激外周多巴胺受体。这不仅需要更高剂量的左旋多巴才能在中枢神经系统达到治疗浓度，还会带来恶心、低血压等副作用。卡比多巴这时就 “上场” 帮忙了，它是芳香族 L - 氨基酸脱羧酶的竞争性抑制剂，无法穿过血脑屏障，和左旋多巴一起使用，可以减少左旋多巴在外周转化为多巴胺，降低其全身代谢，增加中枢暴露，从而减少左旋多巴的用量。

然而，当前的治疗方案并不完美。患者需要每天多次口服药片，这不仅麻烦，还容易出现漏服或重复服药的情况。而且，左旋多巴的半衰期短，首过效应导致其代谢广泛，使得药物血浆浓度波动很大。为了解决这些问题，人们尝试开发了多种新剂型，比如 Sinemet CR 缓释片，虽然它能让左旋多巴的血浆浓度更稳定，但生物利用度却不如普通片；Novartis 公司的 “Stalevo” 片，虽然能减少服药次数，但由于左旋多巴作用时间短，还是得每 3 - 4 小时吃一次；还有 Duodopa 十二指肠持续输注，能维持稳定的血浆浓度，可它只能使用 16 小时，而且使用设备时不良事件发生概率高。此外，透皮贴剂需要每天更换，干粉吸入器会引起咳嗽，这些剂型都存在各自的缺点。

在分析方法方面，高效液相色谱（High - Performance Liquid Chromatography，HPLC）是常用的药物分析技术，但已有的用于同时测定左旋多巴和卡比多巴的 HPLC 方法存在不少问题。有的运行时间长、进样体积大；有的需要复杂的样品制备过程，还依赖不常见的荧光检测器；有的使用高比例有机溶剂或强酸性流动相，会损坏色谱柱；还有的使用特殊的电化学检测器，存在监管方面的问题。其他分析方法，如分光光度法、核磁共振光谱法等，也存在线性范围窄、缺乏选择性和稳定性数据、方法通用性不足等缺点，而且都无法分离药物和亚硫酸氢钠的峰，这对于体外释放样品的分析来说是个很大的阻碍。

另外，HPLC 分析中使用的有机溶剂如果处理不当，会对环境造成污染，还会危害分析人员的健康。随着人们对环境保护的重视，绿色分析化学（Green Analytical Chemistry，GAC）的理念越来越受到关注，开发更环保的分析方法变得十分必要。

为了解决这些问题，来自澳大利亚南澳大学药物创新中心等机构的研究人员，在《BMC Chemistry》期刊上发表了一篇名为 “Analytical method for simultaneous quantification of levodopa and carbidopa in the injectable oleogel formulation by HPLC” 的论文。他们成功开发了一种准确、精密且选择性高的 HPLC 方法，可用于测定左旋多巴和卡比多巴在原料药、油凝胶及释放介质中的含量，并且对该方法进行了绿色化学评估，为优化长效注射剂的研发和质量控制提供了有力的工具。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是 HPLC 技术，使用配备特定部件的 HPLC 系统，搭配 Luna - C18 色谱柱，通过优化的梯度洗脱程序来分离和检测左旋多巴、卡比多巴以及亚硫酸氢钠；其次是运用多种软件辅助实验，如 LabSolutions 软件用于数据处理和收集，GraphPad Prism 软件用于计算检测限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantification，LOQ）等参数；最后，使用多种绿色度评估工具，如分析生态规模评估（Analytical Eco - Scale Assessment，ESA）、ComplexMoGAPI 和分析绿色度度量方法及软件（Analytical GREEnness Metric Approach and Software，AGREE）等来评估所开发方法对环境的影响 。

下面来看看研究人员都有哪些重要发现。

分析方法的开发

左旋多巴和卡比多巴在释放介质（pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水）中不稳定，研究人员筛选后发现，添加 0.2% 的亚硫酸氢钠可以保持它们的稳定性。在开发 HPLC 方法时，研究人员尝试了不同的梯度系统，发现不加四丁基硫酸氢铵时，亚硫酸氢钠会和左旋多巴一起洗脱，还出现了峰拖尾现象。后来，加入 0.5% 的三乙胺减少了峰拖尾，再加入四丁基硫酸氢铵作为阳离子离子对试剂，成功实现了左旋多巴、卡比多巴和亚硫酸氢钠的良好分离，优化了峰形和分辨率。

方法的选择性

研究人员用释放介质和流动相稀释样品进行检测，发现制剂中的辅料不会干扰两种药物的 HPLC 分析，空白凝胶样品在左旋多巴和卡比多巴的保留时间处也没有额外峰。在释放介质中，亚硫酸氢钠在 4.99min 出现一个额外峰，这表明该方法的选择性良好。

验证参数

• 稳健性：研究人员故意改变色谱方法的条件，如改变 pH 值（±0.2）、柱温（-5°C）和磷酸钾的摩尔浓度（35mM），结果发现这些微小变化对分析物的回收率没有影响，说明该方法很稳健。
• 线性和范围：在 10 - 100μg/ml 的浓度范围内，两种药物的校准曲线都呈现良好的线性关系，回归系数（）大于 0.999。
• 检测限和定量限：根据计算，左旋多巴的检测限为 3.7μg/ml，定量限为 9.91μg/ml；卡比多巴的检测限为 1.59μg/ml，定量限为 4.82μg/ml。
• 系统适用性：系统适用性参数都在 FDA 规定的可接受范围内，说明仪器和分析条件适合进行检测。
• 溶液稳定性：两种分析物在流动相中，室温及 4°C 下 14 天内都很稳定；在释放介质中，左旋多巴在室温及 4°C 下 14 天内稳定，而卡比多巴在室温下 3 天后开始降解，所以释放介质需要每天更换。
• 准确性：通过计算不同浓度下左旋多巴和卡比多巴的回收率来评估准确性，结果显示回收率在 98 - 102% 之间，符合可接受范围。
• 精密度：日内和日间精密度的相对标准偏差（% RSD）都小于 2%，说明该方法的重复性和重现性良好。

开发的分析方法在油凝胶配方过程中的应用

• 油凝胶的药物含量：研究人员用开发的分析方法成功测定了油凝胶中的药物含量，左旋多巴和卡比多巴的回收率分别为 101.97% 和 96.93%。用同样的提取方法处理纯药物，回收率也符合要求，而且空白凝胶样品没有峰，进一步验证了提取方法的可靠性。
• 药物释放研究：研究人员使用透析袋进行油凝胶的体外药物释放测试，发现初期有突释现象，左旋多巴释放 27.75%，卡比多巴释放 23.19%，之后释放速度变慢，可持续 7 天。而且，该方法能完全分离药物和亚硫酸氢钠的峰，便于分析释放样品。

色谱方法的绿色度评估

研究人员从环保角度优化了方法，尽量减少有害试剂的使用，降低废物产生和能源消耗。他们使用多种绿色度评估工具对方法进行评估，ESA 工具给该方法的评分高于 75 分，评为 “优秀的绿色分析”；ComplexMoGAPI 工具给出的评分为 76 分，表明该方法具有良好的环境可持续性；AGREE 工具评分为 0.53 分（满分 1 分），对应淡绿色阴影，显示该方法在一些方面符合绿色实践。此外，BAGI 工具评分为 75 分，反映出该方法在常规使用方面适用性强。综合这些评估结果，说明该方法在绿色度和实用性之间达到了较好的平衡。

总的来说，这项研究开发的 HPLC 方法可以准确测定左旋多巴和卡比多巴的含量，还能有效分离药物和亚硫酸氢钠的峰，适用于体外释放样品的分析。而且，该方法各项验证参数良好，在绿色化学方面表现出色，具有良好的环境可持续性和实用性。这一成果为帕金森病治疗药物的研发和质量控制提供了重要的技术支持，有助于开发更有效的长效注射剂，提高患者的治疗效果和生活质量，同时也为绿色分析化学在药物分析领域的应用提供了有益的参考，推动了相关领域的发展。