强强联合：核糖核苷酸还原酶与 WEE1 联合抑制，为尤因肉瘤治疗带来新曙光

为解决尤因肉瘤（ES）治疗难题，耶拿大学医院等机构研究人员开展 RNR 和 WEE1 联合抑制研究。结果显示该联合治疗在体外对 ES 细胞有协同抗癌活性。推荐阅读，助您了解这一潜在治疗新策略。

　　

在儿童癌症的世界里，尤因肉瘤（Ewing’s sarcoma，ES）是一种令人闻风丧胆的 “小恶魔”，它主要盯上孩子们的骨头和软组织。一直以来，医生们对抗它的 “常规武器” 是先进行高强度的新辅助诱导化疗，接着手术或者放疗，最后再用辅助巩固化疗收尾。经过多年努力，早期发现且病情局限的患者，5 年生存率从化疗出现前的不到 10% 一路涨到了如今的 75% 左右，这无疑是巨大的进步。

但这个 “小恶魔” 可没那么容易对付，那些一开始就出现癌细胞扩散，或者病情复发的患者，预后情况依旧糟糕，5 年生存率连 40% 都不到。而且从世纪之交开始，化疗的效果提升就陷入了瓶颈，不管怎么调整化疗药物的剂量和组合，都很难让患者的治疗效果再有明显改善。所以，开发新的治疗策略迫在眉睫。

尤因肉瘤有个特别之处，它是因为染色体发生平衡易位，产生了融合致癌基因。其中最常见的情况是 85% 的患者会出现 t (11;22)(q24;q12) 易位，这会让 FET 家族的尤因肉瘤断点区域 1（EWSR1）基因和 ETS 家族的 Friend 白血病病毒整合 1（FLT1）基因融合，进而生成融合癌蛋白 EWS::FLI1。这个蛋白就像个 “捣乱分子”，会调控一堆和细胞增殖、迁移、周期控制、死亡以及信号转导相关的基因，在癌细胞的 “疯狂生长计划” 里起关键作用。理论上，EWS::FLI1 是个很好的治疗靶点，但它作为转录因子，直接针对它治疗困难重重。

不过别担心，研究人员发现可以从它的下游 “下手”。EWS::FLI1 会搞出很多乱子，比如促进 R 环形成，阻碍 BRCA 发挥作用，让癌细胞呈现出 “BRCAness” 表型，导致细胞内复制压力爆表。这反倒让尤因肉瘤细胞对针对复制应激反应（RSR）的药物特别敏感。ATR/CHK1/WEE1 信号级联反应在 RSR 里是个关键角色，自然也成了很有潜力的抗癌靶点。之前的研究已经证明，ATR、CHK1 和 WEE1 抑制剂单独使用时，对尤因肉瘤细胞都有一定的杀伤作用。而且针对 RSR 治疗还有个好处，癌细胞比正常细胞更依赖 RSR 来增殖和存活，这样用药时能减少对正常细胞的伤害，降低药物副作用。

但问题来了，这些针对 RSR 的药物单枪匹马作战时，在大多数肿瘤治疗中都很难持续发挥作用，对尤因肉瘤患者来说，单药治疗也很难让病情得到长期缓解。而核糖核苷酸还原酶（RNR）抑制剂（RNRi）或许能成为 RSR 靶向药物的 “得力助手”。RNR 在合成脱氧核糖核苷酸（dNTPs）的过程中起着关键作用，就像个 “开关”，控制着 dNTPs 的产量。RNR 的亚基 M2（RRM2）如果过度表达，会增加 dNTPs 的供应，帮助癌细胞从复制应激中恢复过来，抵消 RSR 靶向药物的效果。在尤因肉瘤患者中，RRM2 过表达和较差的总生存率有关，它也被认定为潜在的治疗靶点。可是，虽然尤因肉瘤细胞一开始对 RRM2 抑制剂曲拉滨（triapine）有反应，但时间一长就会产生耐药性，这说明 RNRi 单药治疗也不足以长期控制病情。

既然单药治疗都有局限，那联合治疗会不会是 “破局之法” 呢？之前研究人员发现 ATR 抑制剂和 RNRi 联合使用，能对尤因肉瘤细胞产生协同抗肿瘤作用。这次，来自耶拿大学医院（Jena University Hospital）等机构的研究人员决定进一步探索，看看 RNRi 和 WEE1 抑制剂联合使用效果如何。他们的研究成果发表在了《BMC Cancer》期刊上，论文标题是 “Combined inhibition of ribonucleotide reductase and WEE1 induces synergistic anticancer activity in Ewing’s sarcoma cells” 。研究发现，RNRi 和 WEE1 抑制剂联合使用，能在体外对尤因肉瘤细胞产生强大的协同抗癌作用，这为后续在体内研究这种联合治疗方案的潜力提供了重要依据。

为了开展这项研究，研究人员主要用了以下几种技术方法：首先是细胞培养技术，他们培养了不同 p53 状态的尤因肉瘤细胞系；接着用流式细胞术，通过检测细胞死亡、线粒体膜电位丧失和 DNA 片段化情况，来判断药物对细胞的影响；还用了 caspase 3/7 活性测定法，检测细胞内 caspase 3/7 的活性；免疫印迹技术则用于检测相关蛋白的表达和磷酸化水平；实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）用来分析基因表达变化；最后用组合指数（CI）分析评估药物之间的相互作用。

下面来看看研究的具体结果：

联合治疗协同诱导尤因肉瘤细胞死亡

研究人员挑选了三种不同 p53 状态的尤因肉瘤细胞系，分别是 p53 野生型的 WE-68 细胞、p53 纯合错义突变（C176F）的 SK-ES-1 细胞和 p53 缺失的 A673 细胞。他们让这些细胞和 RNRi 曲拉滨、WEE1 抑制剂阿维色替布（adavosertib）“短兵相接” 48 小时。结果发现，单独使用曲拉滨或者阿维色替布时，在研究的浓度范围内，最多只能让 WE-68 和 A673 细胞的死亡率达到 23.4 ± 3.9% 。但当这两种药联合起来，就像组成了 “超级战队”，WE-68 和 A673 细胞的死亡率最高能飙升到 57.8 ± 4.5% 。SK-ES-1 细胞对曲拉滨更敏感，单药处理时死亡率最高能到 38.4 ± 1.5% ，和阿维色替布联合后，死亡率更是高达 77.4 ± 2.8% 。用 CI 方法分析后发现，在大多数药物浓度组合下，这种联合治疗都能产生协同效应。研究人员还测试了另一种 WEE1 抑制剂 ZN-c3，它和曲拉滨联合使用诱导的细胞死亡情况，和阿维色替布与曲拉滨联合时差不多，同样具有协同效应。

联合治疗诱导细胞凋亡

为了搞清楚联合治疗导致细胞死亡的 “秘密武器”，研究人员进行了一系列实验。他们发现，细胞死亡的很多途径都和线粒体有关，于是先用流式细胞术检测了曲拉滨和阿维色替布联合处理后，细胞线粒体膜电位（Δψm）的变化。结果显示，单独用药时对 Δψm 的影响较弱，联合用药后，WE-68 细胞中高达 94.3 ± 0.4% 、A673 细胞中高达 81.6 ± 2.0% 出现了 Δψm 下降。在 SK-ES-1 细胞中，联合用药也让 Δψm 下降的比例从单药曲拉滨处理时的 57 ± 4.1% 增加到了 90.9 ± 0.7% 。接着，研究人员检测了 caspase 3/7 的活性，这是判断细胞是否发生凋亡的一个重要指标。在 WE-68 和 SK-ES-1 细胞中，联合治疗激活 caspase 3/7 的效果比单药治疗强很多。不过在 A673 细胞中，联合治疗对 caspase 3/7 的激活作用较弱。为了验证 caspase 3/7 激活是不是联合治疗导致细胞死亡的关键因素，研究人员用了泛半胱天冬酶抑制剂 z-VAD-fmk。结果发现，它能明显抑制 WE-68 和 SK-ES-1 细胞的死亡，但对 A673 细胞效果不明显，这和之前 caspase 3/7 活性检测的结果一致。同时，z-VAD-fmk 还能减轻 WE-68 细胞中联合治疗引起的 Δψm 下降。此外，通过检测 DNA 片段化情况，研究人员发现联合治疗能引发三种细胞系的 DNA 片段化，而 z-VAD-fmk 能完全阻止 WE-68 细胞的 DNA 片段化，对 SK-ES-1 和 A673 细胞也有部分阻止作用。这些结果都表明，联合治疗是通过诱导细胞凋亡来杀死尤因肉瘤细胞的。曲拉滨和 ZN-c3 联合使用时，也能产生类似的诱导细胞凋亡的效果。

阿维色替布与 PARP 抑制剂联合效果较弱

研究人员还把 WEE1 抑制剂和聚（ADP - 核糖）聚合酶（PARP）抑制剂联合起来进行测试。PARP 在 DNA 损伤修复中作用很大，也是癌症治疗的重要靶点，尤其是对尤因肉瘤。他们测试了奥拉帕利（olaparib）和维利帕利（veliparib）这两种 PARP 抑制剂和阿维色替布联合使用的效果。结果发现，这两种 PARP 抑制剂和阿维色替布联合使用时，虽然也有协同效应，但相比 RNRi 和 WEE1 抑制剂的联合，效果要弱一些。

联合治疗加剧复制应激反应并激活 p53

研究人员想知道联合治疗是怎么发挥作用的，于是检测了 CHK1 的磷酸化情况，因为 CHK1 磷酸化是复制应激的可靠标志。免疫印迹结果显示，曲拉滨和阿维色替布、曲拉滨和 ZN-c3 联合治疗，都能让三种细胞系中 CHK1 的磷酸化水平比单药治疗时明显提高，说明联合治疗加剧了复制应激。同时，联合治疗还会让 CHK1 蛋白表达下降，在 A673 细胞中尤其明显。p53 作为肿瘤抑制蛋白，在癌症治疗中很关键。研究人员发现，在 p53 野生型的 WE-68 细胞中，两种联合治疗都能增加 p53 的水平；在 p53 突变的 SK-ES-1 细胞中，p53 虽然已经处于高水平，但联合治疗没有让它进一步增加；p53 缺失的 A673 细胞自然没有 p53 表达。而且联合治疗对 TP53 基因表达没有影响，说明是在转录后水平影响 p53 的丰度。进一步研究发现，联合治疗还能强烈诱导 p53 野生型细胞中两个主要的 p53 靶基因 CDKN1A（编码细胞周期抑制蛋白 p21）和 BBC3（编码促凋亡蛋白 PUMA）的表达。在 p53 突变细胞中，虽然诱导程度比野生型细胞低，但也有一定的诱导作用。

综合这些研究结果，研究人员认为 RNRi 和 WEE1 抑制剂联合使用，是治疗尤因肉瘤很有潜力的策略。之前的研究表明 RNRi 和 ATR 抑制剂联合有协同抗癌作用，这次又发现 RNRi 和 WEE1 抑制剂联合也效果显著，这进一步支持了联合靶向 RNR 和 ATR 通路治疗尤因肉瘤的思路。

值得一提的是，他们发现 ZN-c3 对尤因肉瘤细胞有效，这是之前没报道过的，说明 WEE1 抑制剂可能存在 “类效应” ，而且 ZN-c3 相比其他 WEE1 抑制剂，可能在激酶选择性上更有优势。联合治疗诱导细胞死亡主要是通过线粒体凋亡途径，并且不受细胞 p53 突变状态的影响。这对临床治疗意义重大，因为虽然尤因肉瘤患者中 TP53 突变的比例不高，但这部分患者对放化疗不敏感，预后很差。研究中发现联合治疗对 TP53/STAG2 双突变的 SK-ES-1 细胞也有效，这意味着它可能为那些难治性尤因肉瘤患者带来新的希望。

不过这项研究也有一些局限性，比如没有深入探究联合抑制 RNR 和 WEE1 的具体机制，而且只在体外进行了研究，还不清楚联合治疗在体内会不会有不良反应。但不管怎么说，这项研究为后续的临床前体内研究以及可能的临床应用奠定了坚实的基础，未来或许真的能成为对抗尤因肉瘤这个 “小恶魔” 的有力武器，给患者带来更多生的希望。