揭秘牛肠道病毒 “帮凶”：BEV 2C 蛋白如何操控 NF-κB 通路助力病毒复制？

为探究 BEV 逃避宿主免疫及促进复制的机制，吉林大学研究人员开展 BEV 2C 蛋白相关研究，发现其抑制 NF-κB 通路促病毒复制。该成果有助于理解肠道病毒致病机制，为抗 BEV 药物研发提供新思路，值得科研读者一读。

　　

在畜牧业中，牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）可谓是让养殖户们头疼不已的 “大反派”。它属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae family）肠道病毒属（Enterovirus genus），是一种单链、正链 RNA 病毒。一旦牛群感染了 BEV，就会引发严重的消化和呼吸系统疾病，导致较高的死亡率，给全球养牛业带来巨大的经济损失。

BEV 的基因组约有 7400 个核苷酸那么长，里面藏着能编码多蛋白前体的开放阅读框，这个多蛋白前体随后会被切割成 4 种结构蛋白（VP1、VP2、VP3 和 VP4）和 7 种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D）。其中，非结构蛋白 2C 是个 “厉害角色”，它由大约 330 个氨基酸残基组成，包含多个功能结构域，在病毒的生命周期中身兼数职，像病毒脱壳、宿主细胞膜重排、RNA 结合与复制、衣壳化和形态发生等过程都有它的 “身影”。虽然科学家们对 2C 的结构和功能有了一定了解，但它与宿主蛋白之间的关系，以及在宿主先天免疫反应中扮演的角色，仍然是谜团重重。

在动物的身体里，先天免疫系统是抵御病毒入侵的 “第一道防线”。当宿主通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别出病原体相关分子模式（pathogen - associated molecular patterns，PAMPs）时，就会启动抗病毒的先天免疫反应。在这个过程中，NF - κB（核因子 κB，一种在免疫反应中起关键作用的蛋白质复合物）信号通路至关重要，它的激活能够诱导干扰素 β（IFN - β）、主要组织相容性复合体 I 类（MHC class I）和一些炎性细胞因子的表达，从而限制病毒的复制。

然而，病毒也很 “狡猾”，它们会想出各种策略来逃避宿主的免疫攻击，维持自身的复制。许多病毒会编码一些蛋白质，通过干扰 NF - κB 信号通路来破坏或调节免疫反应。之前的研究发现，BEV 感染会引发细胞因子风暴，促炎和炎性细胞因子水平升高，而且细胞因子的动态表达模式与病毒复制或滴度呈负相关。因此，吉林大学的研究人员推测，BEV 可能进化出了干扰 TNF - α（肿瘤坏死因子 α，一种能刺激 NF - κB 激活途径的细胞因子）诱导的 NF - κB 激活的策略，以此来逃避宿主的免疫反应。

为了揭开这个谜团，吉林大学的研究人员在《Veterinary Research》期刊上发表了题为 “BEV 2C protein inhibits the NF - κB signalling pathway to promote viral replication by targeting IKBKB and p65” 的论文。他们发现，BEV 的 2C 蛋白通过抑制 NF - κB 信号通路来促进病毒复制，这一发现为理解肠道病毒的致病机制和开发抗 BEV 药物提供了新的思路，就像在黑暗中为研究肠道病毒点亮了一盏明灯。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。他们用了报告基因检测（Reporter gene assays），通过检测荧光素酶的活性来评估 NF - κB 信号通路的激活情况；利用共聚焦显微镜（Confocal microscopy）观察细胞内蛋白的定位，就像给细胞内的蛋白 “拍照”，看看它们都在哪里 “活动”；还进行了免疫沉淀（Immunoprecipitation）和免疫印迹分析（Immunoblot analysis），以此来确定蛋白质之间的相互作用和蛋白质的表达水平；实时逆转录聚合酶链反应（Real - time reverse transcription polymerase chain reaction，qPCR）则帮助他们测定了 mRNA 的表达水平。

下面我们来详细看看研究结果。

1. BEV 抑制 TNF - α 触发的 NF - κB 激活：研究人员通过免疫印迹和共聚焦显微镜观察发现，感染 HY12 病毒的 MDBK 细胞和 293T 细胞，在 TNF - α 刺激后，细胞核中 p65（NF - κB 的一个关键亚基）的含量明显低于未感染的细胞。这表明 HY12 感染抑制了 TNF - α 介导的 p65 核转位。另外，用报告基因检测发现，感染 BEV 的细胞中荧光素酶活性显著低于未感染细胞，说明 BEV 感染抑制了 NF - κB 信号通路。定量 RT - PCR 结果显示，HY12 显著抑制了 TNF - α 诱导的 IL - 8、IL - 1β 和 TNF - α 基因的 mRNA 表达水平。这一系列研究结果都表明，BEV 能显著抑制 TNF - α 触发的 NF - κB 信号通路。
2. BEV 2C 蛋白抑制 NF - κB 激活以促进病毒复制：研究人员用荧光素酶报告基因检测筛选了 HY12 编码的 11 种结构或非结构蛋白，发现 2C 蛋白对 TNF - α 触发的 NF - κB 启动子激活的抑制作用最大，而且这种抑制作用呈剂量依赖性。同时，过表达 2C 蛋白的 293T 细胞中，IL - 8、IL - 1β 和 TNF - α 的 mRNA 表达水平显著降低。进一步研究还发现，过表达 2C 增强了 HY12 的复制，病毒滴度也有所增加。这说明 2C 蛋白在 BEV 复制中起到了正向调节作用。
3. BEV 2C 蛋白通过抑制 IKBKB 的表达来抑制 NF - κB 激活：通过蛋白质免疫印迹分析，研究人员发现过表达 2C 的感染细胞中，IKBKB、p - IκBα 和 p - p65 的表达水平显著降低，而 IκBα 的表达水平显著升高。对用 TNF - α 处理不同时间的 293T 细胞进行蛋白质免疫印迹分析，也发现 2C 抑制了 TNF - α 触发的 NF - κB 信号通路，导致 IKBKB 表达下调。而且，2C 过表达还使 IKBKB 的 mRNA 水平呈剂量依赖性下降。这些结果表明，BEV 2C 通过下调 IKBKB 的表达来抑制 NF - κB 激活。
4. BEV 2C 直接与 p65 相互作用：研究人员通过共转染 Flag 标记的 2C 和 His 标记的 p65 质粒，然后进行共免疫沉淀实验，发现 2C 和 p65 能够相互沉淀，说明它们之间存在相互作用。共聚焦显微镜观察也证实了 2C 和 p65 在细胞质中共定位。在 HY12 感染的 293T 细胞中，也检测到了 2C 和 p65 的内源性相互作用。而且，原核表达的 His - 2C 蛋白能够成功拉下 Myc 标记的 p65，表明 BEV 2C 直接与 p65 相互作用。
5. BEV 2C 蛋白与 p65 的 IPT 结构域相互作用并抑制 p65/p50 二聚化：研究人员构建了截断的 p65 突变体进行免疫沉淀实验，发现 p65 的 195 - 290 aa 区域（对应 IPT 结构域）与 2C 相互作用。进一步实验表明，2C 抑制了 p50 和 p65 的结合，减少或破坏了 p65/p50 二聚体的形成。
6. 2C 的 N 端 118 - 121 aa 与 p65 的 IPT 结构域相互作用：研究人员构建了一系列截断的 2C 突变体，通过免疫沉淀实验发现，2C 的 1 - 125 aa 片段能与 p65 结合，进一步研究确定 118 - 121 aa 这四个氨基酸是 2C 与 p65 的 IPT 结构域相互作用的位点。
7. 2C 的 N 端 1 - 121 aa 抑制 p65 磷酸化和核转位以促进病毒复制：研究人员用 TNF - α 处理转染了 pEGFP - 2C - 1 - 121 的 293T 细胞，通过蛋白质免疫印迹分析发现，与空载体对照相比，转染 2C 1 - 121 质粒的细胞中 p - p65 的表达水平显著降低，且这种抑制作用呈剂量依赖性。免疫印迹分析和共聚焦显微镜观察都表明，2C 1 - 121 抑制了 TNF - α 触发的 p65 从细胞质到细胞核的转位。感染 HY12 病毒后，过表达 2C 1 - 121 的细胞中 HY12 - VP1 的 mRNA 和蛋白水平显著增加，说明 2C 1 - 121 对 BEV 复制至关重要，并能促进其复制。
8. EV - F 感染细胞中 2C 蛋白对 NF - κB 信号通路的抑制作用：对 EV - F 和 EV - E 代表性菌株的 2C 蛋白进行序列比对分析，发现 HY12 - 2C 与 p65 相互作用的 118 - 121 aa 区域在这些病毒中高度保守。用代表性的 EV - F 菌株 SD - S67 进行实验，发现感染 SD - S67 的细胞中荧光素酶活性显著低于未感染细胞，且 SD - S67 显著抑制了 TNF - α 诱导的 IL - 8、IL - 1β 和 TNF - α 基因的 mRNA 表达水平，说明 SD - S67 感染抑制了 NF - κB 信号通路。双荧光报告基因检测显示，SD - S67 的 2C 蛋白对 NF - κB 启动子的抑制呈剂量依赖性，蛋白质免疫印迹分析表明它也抑制了 IKBKB 蛋白的表达、IκB - α 的磷酸化和降解，共免疫沉淀实验证实了 SD - S67 病毒编码的 2C 蛋白与 p65 蛋白相互作用。这表明 EV - F - 2C（SD - S67）与 EV - E 2C 蛋白对 NF - κB 激活的抑制作用及机制相同，说明 EV - F 或 EV - E 编码的 2C 对 NF - κB 激活的抑制具有普遍性。

综合这些研究结果，研究人员发现 BEV 通过 2C 蛋白抑制 NF - κB 信号通路来促进病毒复制。一方面，2C 蛋白抑制 IKBKB 的表达，阻断了下游 IκBα 和 p65 的磷酸化，进而抑制了 NF - κB 信号通路；另一方面，2C 蛋白直接与 p65 相互作用，阻断 p65/p50 二聚化，抑制 p65 的磷酸化和核转位，同样抑制了 NF - κB 信号通路。

在讨论部分，研究人员提到，先天免疫系统是宿主抵御病毒感染的重要防线，许多病毒都进化出了调节 NF - κB 通路来逃避宿主免疫反应的机制。BEV 的 2C 蛋白抑制 NF - κB 信号通路的方式是一种新发现的策略，与其他肠道病毒有所不同。确定 2C 蛋白与 p65 相互作用的关键位点，对于寻找新的药物靶点和开发新型疫苗具有重要意义。这一研究成果就像是为对抗肠道病毒感染提供了一把新的 “钥匙”，为后续的研究和治疗开辟了新的方向，有望帮助养殖户们解决 BEV 带来的难题，守护牛群的健康，推动养牛业的健康发展。