《Cell Communication and Signaling》小胶质细胞竟掌控视网膜血管发育与 Müller 细胞成熟，背后机制大揭秘

为探究小胶质细胞对 Müller 细胞依赖的视网膜内血管发育的影响，塔夫茨大学医学院等机构的研究人员开展相关研究，发现小胶质细胞缺失会降低 Müller 细胞成熟度和视网膜内血管密度。该研究为视网膜血管疾病研究提供新思路，值得科研人员一读。

　　

在我们眼睛的视网膜中，有一套精密的血管网络，它对于视网膜这个高度耗能的神经组织来说，就像城市的供水供电系统一样重要。视网膜血管系统由浅表、中间和深层三个相互连接的血管丛组成，其发育过程受到多种细胞间相互作用的严格调控。

在小鼠出生后的第一周，就像一支听从指挥的工程队，内皮尖端细胞会沿着星形胶质细胞的 “路线图”，构建出浅表血管层。而从出生后第二周开始，内皮尖端细胞又会依据 Müller 细胞（视网膜中最丰富的固有神经胶质细胞，几乎贯穿整个视网膜厚度，能调节多种视网膜功能，包括视网膜内血管生长和维持血视网膜屏障）发出的信号，深入视网膜，逐步搭建起中间和深层血管丛。

此前的研究发现，Müller 细胞在视网膜内血管生长调控中起着关键作用。例如，在发育过程中，Müller 细胞特异性缺失转录因子缺氧诱导因子（Hif）2α 或 Hif 响应的血管内皮生长因子 - a（Vegfa ，一种能吸引内皮尖端细胞穿透视网膜形成内视网膜血管层的重要因子），会导致视网膜内血管生长不良 。即便是在成年阶段，去除视网膜中的 Müller 细胞，也会引发血管异常和血 - 神经屏障的破坏。

除了 Müller 细胞，小胶质细胞（视网膜中的常驻免疫细胞）也在视网膜内血管形成过程中与内皮尖端细胞密切互动，对血管密度进行调控。在之前的研究中，包括本文作者所在团队的研究，都发现小胶质细胞在浅表血管发育过程中，能像勤劳的 “清洁工” 一样，通过补体激活吞噬并清除死亡的星形胶质细胞，助力形成有序的星形胶质细胞 / 浅表血管网络。而且在视网膜发育过程中，Müller 细胞和小胶质细胞之间的相互作用有助于清除凋亡细胞。

然而，小胶质细胞和 Müller 细胞之间的相互作用是否会影响视网膜深层和中间血管丛的密度或发育，这还是一个未解之谜。为了揭开这个谜团，来自塔夫茨大学医学院眼科（Department of Ophthalmology, Tufts University School of Medicine）等机构的研究人员，在《Cell Communication and Signaling》期刊上发表了题为 “Microglial depletion decreases Müller cell maturation and inner retinal vascular density” 的论文。他们发现，小胶质细胞在促进视网膜内血管生成和 Müller 细胞成熟方面发挥着重要作用，这一发现为深入理解视网膜血管发育机制提供了新的视角。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种技术方法。他们首先通过给怀孕的母鼠喂食含有 Csf1r 拮抗剂（PLX5622）的食物，实现了对小鼠视网膜发育过程中小胶质细胞的特异性清除。接着，利用免疫染色技术，对视网膜内血管生长的发育进程、小胶质细胞清除对血管生长和 Müller 细胞标记物表达的影响进行了细致的观察和分析。此外，研究人员还采用 mRNA 测序（mRNA-seq）和定量聚合酶链反应（qPCR）技术，深入分析了对照组和小胶质细胞缺失组基因表达的差异，从而揭示小胶质细胞在视网膜血管发育中的分子机制。

下面我们一起来看看具体的研究结果。

内皮尖端细胞在视网膜内血管丛形成过程中与 Müller 细胞和小胶质细胞相互作用

视网膜血管生成是分阶段进行的。在第一阶段，浅表血管网络由星形胶质细胞介导形成；而第二阶段，深层和中间血管网络则由 Müller 细胞驱动形成，最终构建出复杂的三层血管网络。研究人员通过对视网膜平铺片进行免疫染色分析，发现视网膜内血管丛的生长在出生后第 10 天（P10）达到高峰，并在出生后第 15 天（P15）左右完成发育。进一步观察 P10 视网膜冷冻切片发现，内皮尖端细胞在视网膜内血管发育过程中，会沿着 Müller 细胞体迁移。为了探究小胶质细胞与 Müller 细胞和内皮细胞之间的相互作用，研究人员对 P10 视网膜冷冻切片和平铺片进行了多种标记物的免疫染色，结果显示小胶质细胞与 Müller 细胞以及正在发育的深层和中间血管丛紧密相连。

小胶质细胞的缺失会降低视网膜内血管密度

研究人员利用 Csf1r 拮抗剂（PLX5622）成功清除小胶质细胞后，对对照组和小胶质细胞缺失组的视网膜进行了分析。他们发现，与对照组相比，小胶质细胞缺失组视网膜的深层和中间血管密度显著降低，幅度超过 50%。由于 Vegfa 异构体在视网膜血管生成中起着关键作用，研究人员检测了 Vegfa 转录本的表达水平，结果发现小胶质细胞缺失组中所有三种 Vegfa 异构体（120、164 和 188）的转录本水平均显著下降。为了进一步探究小胶质细胞缺失与视网膜内血管密度降低之间的分子联系，研究人员对 P10 视网膜进行了 mRNA 测序。

小胶质细胞的缺失显著降低了特定 Müller 细胞标记物的转录水平

RNA 测序数据证实，PLX5622 处理显著降低了小胶质细胞特异性基因（如 P2ry12、Tmem119 和 Fcrls）的转录水平，同时增加了星形胶质细胞标记物（如 Pax2、Gfap、Pdgfra）的表达水平，但小胶质细胞的消融并未诱导 Müller 细胞发生反应性胶质化。令人感兴趣的是，研究人员发现小胶质细胞缺失的视网膜中，特定 Müller 细胞标记物（如 Glul、Kir4.1、Kir2.1、Aqp4）的转录水平显著下调。通过通路分析，研究人员发现小胶质细胞缺失的视网膜中，参与吞噬作用、补体系统和免疫反应的基因显著下调，同时参与水运输、钾离子稳态和谷氨酰胺生物合成的基因也显著下调，而这些基因在 Müller 细胞中通常高度表达。

进一步分析发现，小胶质细胞缺失并未显著改变 Müller 细胞中某些转录因子（如 Sox2、Vsx2、Sox8、Sox9 及其上游调节因子 Hes5）的表达水平，也未显著改变其他 Müller 细胞标记物（如 Dkk3、Clu、Rlbp1、Vim、S100a16）的表达水平。这表明小胶质细胞对于某些特定 Müller 细胞标记物的表达是必不可少的。

谷氨酰胺生物合成途径的下调具有特别重要的意义，因为 Müller 细胞是视网膜中谷氨酰胺的主要来源，而谷氨酰胺对于内皮细胞的增殖至关重要。研究人员通过 qPCR 进一步验证了 RNA 测序的结果，发现小胶质细胞缺失的视网膜中 Glul、Kir4.1 和 Aqp4 的基因表达水平显著下调。免疫染色也证实，与对照组相比，小胶质细胞缺失的视网膜中谷氨酰胺合成酶的细胞内定位下调。对 P15 对照组和小胶质细胞缺失组视网膜的检查发现，即使在血管生长完成阶段，小胶质细胞缺失的视网膜中视网膜内血管密度和 Müller 细胞中谷氨酰胺合成酶的表达仍然降低，这表明小胶质细胞缺失导致视网膜内血管生成明显延迟。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：小胶质细胞在促进 Müller 细胞成熟方面发挥着重要作用，而 Müller 细胞成熟对于视网膜内血管发育是必不可少的。小胶质细胞的缺失会导致特定 Müller 细胞成熟标记物的显著减少，进而影响视网膜内血管密度。

在讨论部分，研究人员指出，小胶质细胞是视网膜中动态的免疫细胞群体，在视网膜发育过程中发挥着多种作用。虽然之前的研究已经揭示了小胶质细胞在浅表血管发育中的作用，但对于其在视网膜内深层和中间血管网络形成过程中与 Müller 细胞相互作用的功能意义，我们知之甚少。

在本研究中，小胶质细胞缺失导致视网膜内血管生长显著减少，Vegfa 异构体表达水平降低，同时特定 Müller 细胞标记物的转录水平也发生改变。这表明小胶质细胞可能通过调节 Müller 细胞的功能，影响视网膜内血管生成。此外，研究还发现谷氨酰胺代谢在视网膜血管生成中起着重要作用，小胶质细胞缺失导致谷氨酰胺合成减少，这可能是视网膜内血管密度降低的原因之一。

然而，目前仍不清楚小胶质细胞的缺失是如何导致特定 Müller 细胞标记物（如 Glul）表达下调的。虽然研究发现小胶质细胞缺失的视网膜中双极细胞标记物和视杆细胞相关标记物有所减少，但这些变化与 Glul 表达下调之间的关系还需要进一步研究。另外，Müller 细胞中 Kir4.1 的下调是否与 Glul 和 Aqp4 水平的降低有关，也有待进一步探索。

这项研究的重要意义在于，它揭示了小胶质细胞在视网膜内血管发育和 Müller 细胞成熟过程中的关键作用，为我们理解视网膜血管发育的分子机制提供了新的线索。这一发现可能为视网膜血管相关疾病的治疗提供新的潜在靶点，有助于开发更有效的治疗策略，为相关疾病患者带来新的希望。