《Oncogene》GDP - 甘露糖 4,6 - 脱水酶驱动 MYCN 扩增神经母细胞瘤核心岩藻糖基化与肿瘤发生的关键机制

为解决 MYCN 扩增神经母细胞瘤治疗难题，美国肯塔基大学研究人员开展 GMDS 相关研究。发现 GMDS 影响肿瘤核心岩藻糖基化和肿瘤发生，2 - FF 可抑制肿瘤生长。该研究为治疗提供新思路，值得科研读者一读。

　　

美国肯塔基大学（University of Kentucky）的 Beibei Zhu、Michelle G. Pitts 等研究人员在《Oncogene》期刊上发表了题为 “GDP-mannose 4,6-dehydratase is a key driver of MYCN - amplified neuroblastoma core fucosylation and tumorigenesis” 的论文。这篇论文在神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）研究领域意义重大，为深入了解 MYCN 扩增的神经母细胞瘤的发病机制以及开发新的治疗策略提供了关键线索。

研究背景

神经母细胞瘤是一种极具破坏力的儿童癌症，在所有儿童癌症死亡病例中占比达 15%。N - MYC 作为关键的致癌转录因子，是神经母细胞瘤发生的重要驱动因素。约 40% 的高危神经母细胞瘤存在 MYCN 扩增现象，这一特征足以将肿瘤划分为高危类别。尽管采用了积极的多模式治疗，但高危神经母细胞瘤患儿的 5 年生存率依然很低。目前，虽然对神经母细胞瘤的基因层面研究较为深入，但对其在发育和进展过程中翻译后修饰（蛋白质合成后进行的化学修饰，可影响蛋白质功能）的作用关注较少。N - 糖基化（在蛋白质的特定位置添加糖复合物的过程）作为一种主要的翻译后修饰，在许多成人癌症中呈现出不同的模式，但针对儿科实体瘤原位糖基化变化的研究却很少。此外，岩藻糖基化（将岩藻糖添加到蛋白质和脂质上的过程）在神经母细胞瘤发展中的作用此前也未被阐明。基于以上现状，研究人员开展了此项研究，旨在探究 MYCN 扩增如何影响神经母细胞瘤的糖基化谱，进而寻找新的治疗靶点。

研究方法

1. 基质辅助激光解吸电离质谱成像技术（MALDI - MSI）：对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的神经母细胞瘤样本进行处理，切成 4μm 切片，经脱蜡、抗原修复等步骤后，用 PNGaseF prime 和异淀粉酶酶解，再通过 timsTOF fleX 质谱仪获取 N - 糖链谱图。利用该技术可在原位分析神经母细胞瘤组织中 N - 糖链的分布情况。

2. 数据库分析：借助 R2 微阵列分析和可视化平台中的 Kocak 和 SEQC 数据库，探究参与从头合成 GDP - 岩藻糖的关键基因（GMDS、TSTA3）、GDP - 岩藻糖转运基因（SLC35C1）以及岩藻糖补救途径基因（FUK、FPGT）的表达水平与患者总生存率的关系。

3. 细胞实验：选用多种神经母细胞瘤细胞系，包括 MYCN 非扩增的 SK - N - SH 和 SK - N - AS，以及 MYCN 扩增的 BE (2) - C、CHP - 212 等。通过转染 shRNA 构建稳定敲低 GMDS 的细胞系，或转染过表达载体实现 GMDS 过表达；同时利用 siRNA 干扰 MYCN 表达，或使用 JQ1 抑制溴结构域来调控 MYC 信号通路。采用定量 PCR、蛋白质免疫印迹、免疫组化、基于凝集素的流式细胞术和 ELISA 等方法检测相关基因表达、蛋白质水平和糖基化变化。

4. 动物实验：将稳定转染 shGMDS 或对照 shRNA 的 BE (2) - C 细胞接种到裸鼠皮下，观察肿瘤形成和生长情况；对荷瘤裸鼠给予 2 - 氟岩藻糖（2 - FF）处理，监测肿瘤体积、小鼠生存情况，并进行组织学分析，评估 2 - FF 对肿瘤生长的影响。

研究结果

1. MALDI - MSI 揭示 MYCN 扩增的人神经母细胞瘤中核心岩藻糖基化 N - 糖链丰度增加：通过 MALDI - MSI 分析，研究人员在 5 例 MYCN 扩增和 4 例 MYCN 非扩增的人神经母细胞瘤原发肿瘤中，共鉴定出 59 种 N - 糖链。在富含施万细胞（外周神经系统的主要神经胶质成分，可作为神经母细胞瘤肿瘤分化的标志物）的基质区域，虽然发现了一些差异丰度的 N - 糖链，但由于神经母细胞瘤的异质性，样本量受限且统计效力不足。而在富含神经母细胞（神经母细胞瘤的主要癌细胞）的区域，MYCN 扩增的肿瘤与非扩增的肿瘤相比，有 8 种 N - 糖链丰度增加了两倍，其中 7 种差异丰度的 N - 糖链符合设定的倍数变化和统计阈值，且 6 种具有核心岩藻糖基化特征。此外，MYCN 扩增的肿瘤中两种唾液酸化 N - 糖链的丰度也有所增加，总体核心岩藻糖基化糖链的丰度显著升高。

2. 高从头合成岩藻糖基因表达与晚期神经母细胞瘤和不良总生存相关：通过对 Kocak 和 SEQC 数据库的分析，发现从头合成 GDP - 岩藻糖的关键基因 GMDS 和 TSTA3 的高表达与患者总生存率差、肿瘤处于晚期以及 MYCN 扩增显著相关。FPGT（岩藻糖补救途径中的关键酶编码基因）低表达也与不良预后相关，而 SLC35C1 和 FUK 的表达与患者生存、疾病分期和 MYCN 扩增状态无明显关联。FUT8（介导核心岩藻糖基化最后一步的基因）高表达与不良总生存相关，但与疾病分期和 MYCN 扩增状态无关。基于 GMDS 与不良临床特征的关联及其在从头合成 GDP - 岩藻糖中的关键作用，研究人员将其选为进一步研究的潜在代谢靶点。

3. GMDS 是 N - MYC 的直接转录靶点：在多种神经母细胞瘤细胞系中，MYCN 扩增的细胞系 GMDS 蛋白表达水平更高。通过调节 MYCN 表达，发现 MYCN 与 GMDS 的 mRNA 和蛋白表达呈正相关。荧光素酶报告基因实验表明，高表达的 MYCN 可使 GMDS 启动子活性提高 6 倍。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实 N - MYC 能直接与 GMDS 启动子结合。此外，瞬时敲低 MYCN 或使用 JQ1 抑制 MYC 信号通路，均可降低 GMDS 表达和核心岩藻糖基化水平，且不影响唾液酸化，表明 N - MYC/GMDS 相互作用对调节核心岩藻糖基化具有特异性。

4. GMDS 是神经母细胞瘤核心岩藻糖基化的关键调节因子，并促进神经母细胞瘤的迁移、黏附和肿瘤形成：在 MYCN 扩增的 BE (2) - C 细胞中敲低 GMDS 后，细胞整体、细胞表面和分泌的核心岩藻糖基化糖链水平均降低，补充外源性 L - 岩藻糖可挽救细胞表面和分泌的核心岩藻糖基化糖链丰度，说明岩藻糖补救途径可补偿从头合成的缺陷。敲低 GMDS 还导致细胞黏附能力下降，迁移速度减慢。过表达 GMDS 则可增加细胞整体核心岩藻糖基化糖链丰度，增强细胞黏附能力。在动物实验中，敲低 GMDS 的细胞接种到裸鼠皮下后，肿瘤体积和重量明显低于对照组，尽管部分敲低 GMDS 的肿瘤形成受阻，但肿瘤组织中核心岩藻糖基化糖链丰度无显著差异，提示体内岩藻糖补救途径可能部分补偿了从头合成的阻断。

5. 2 - 氟岩藻糖阻断神经母细胞瘤核心岩藻糖基化并抑制体内肿瘤生长：2 - 氟岩藻糖（2 - FF）是一种岩藻糖类似物，可抑制从头合成岩藻糖的生物合成和岩藻糖基转移酶活性。在体外实验中，2 - FF 成功阻断了神经母细胞瘤的核心岩藻糖基化，降低了细胞黏附能力，抑制了细胞活力并诱导细胞死亡。在体内实验中，给荷瘤裸鼠饮用含 2 - FF 的水后，肿瘤体积显著减小，小鼠生存期延长，肿瘤组织中核心岩藻糖基化糖链丰度降低，出现大面积坏死，且未观察到明显的不良反应和血栓栓塞现象。

研究结论与讨论

这项研究首次利用 MALDI - MSI 技术对人神经母细胞瘤的 N - 糖链进行原位分析，发现 MYCN 扩增的神经母细胞瘤富含神经母细胞区域的核心岩藻糖基化糖链丰度增加。GMDS 作为从头合成 GDP - 岩藻糖的关键酶，是 N - MYC 的直接转录靶点，对神经母细胞瘤的核心岩藻糖基化、细胞黏附、迁移和肿瘤形成至关重要。2 - FF 作为一种有效的岩藻糖基化抑制剂，在体内外均能显著抑制神经母细胞瘤的生长。

这些发现为神经母细胞瘤的研究开辟了新方向。一方面，明确了从头合成 GDP - 岩藻糖途径在 MYCN 扩增的神经母细胞瘤中的关键作用，为开发针对该代谢途径的新型治疗策略提供了理论依据。例如，可以进一步研发更高效、低毒的岩藻糖基化抑制剂，用于临床治疗。另一方面，研究也存在一些局限性，如 MALDI - MSI 分析的临床样本数量有限，动物实验采用的是免疫缺陷小鼠模型，无法完全模拟体内真实的肿瘤微环境。未来的研究需要扩大临床样本量，在更完善的动物模型中验证这些发现，深入探究岩藻糖基化与神经母细胞瘤发生发展的关系，推动神经母细胞瘤治疗领域的进步，为改善高危神经母细胞瘤患儿的预后带来新的希望。