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为解决 IBD 患者 VTE 发病机制不明的问题，爱尔兰皇家外科医学院的研究人员开展组织因子相关研究。结果发现 CD4+TF+ T 细胞及活化 PC 的调节作用。这为理解 IBD 与 VTE 关系及开发新疗法提供依据，强烈推荐科研读者阅读。
爱尔兰皇家外科医学院（RCSI University of Medicine and Health Sciences）的 Gemma Leon、Paula A. Klavina 等研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Tissue factor-dependent colitogenic CD4+ T cell thrombogenicity is regulated by activated protein C signalling” 的论文。这篇论文在炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）与静脉血栓栓塞（Venous Thromboembolism，VTE）关系的研究领域具有重要意义，为深入理解 IBD 患者 VTE 发病机制及开发新的治疗策略提供了关键线索。
研究背景
IBD 是一种慢性胃肠道炎症性疾病，主要分为克罗恩病（Crohn’s Disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC），全球约有 1000 万人受其困扰，且发病率呈上升趋势。IBD 的病理过程在很大程度上由异常的 T 细胞反应介导，尽管出现了针对 T 细胞促炎活性的生物制剂，但许多患者对这些疗法无反应或逐渐产生耐药性。
令人担忧的是，IBD 患者发生 VTE 的风险显著高于普通人群。成年 IBD 患者 VTE 风险是普通人的 3 倍，儿科 IBD 患者更是高达 6 倍。而且，22% 发生 VTE 的 IBD 患者在首次发病后 2 年内死亡，33% 在 5 年内出现复发性 VTE。虽然疾病严重程度、微生物群失调、妊娠、治疗和胃肠道手术等因素都可能增加这一风险，但 IBD 患者 VTE 的分子发病机制仍不清楚。此前研究发现，IBD 发作时，一些急性期促凝和抗纤溶蛋白水平升高，而抗凝蛋白如蛋白 C（Protein C，PC）等减少。同时，IBD 患者的白细胞和血小板会释放更多促凝组织因子（Tissue Factor，TF）阳性微粒。此外，抗凝和抗炎的 PC 途径失调也与 IBD 发病机制有关。尽管有这些发现，但具体的细胞和分子机制仍有待进一步探究。
研究方法
- 样本收集：从参与 Determinants and Outcomes of CHildren and Adolescents with IBD Study（DOCHAS）的儿科 IBD 患者和对照参与者处获取人类样本，包括直肠和结肠活检组织、外周血等。同时，使用雄性 C57BL/6 小鼠和 Rag1 基因敲除小鼠构建 T 细胞转移介导的结肠炎模型。
- 细胞分离与培养：通过淋巴细胞分离液密度梯度离心和阴性磁性选择法，从健康供体、儿科 IBD 患者和非 IBD 对照者的外周血中分离出 CD4+ T 细胞，并在含有不同细胞因子和抗体的培养基中培养，诱导其向不同亚型分化 。
- 检测方法：运用多种实验技术检测相关指标，如利用校准自动凝血酶生成仪检测 CD4+ T 细胞介导的凝血酶生成；通过血浆凝固试验评估血浆凝块形成速率；采用因子 Xa 生成试验测定 T 细胞表面 TF 活性；使用 ELISA 检测细胞因子水平；运用 mRNA 分离和 RT-qPCR 技术检测基因表达；借助流式细胞术分析细胞表面分子表达和细胞内蛋白表达；通过免疫荧光染色观察组织中细胞的分布和 TF 表达情况；对 RNA-seq 数据进行分析，研究基因表达差异和相关信号通路。
研究结果
- IBD 患者和结肠炎小鼠结肠组织富含 CD4+TF+ T 细胞：研究人员分析了公开的儿科 IBD 患者肠道活检转录组数据，发现 CD 患者回肠或结肠组织中 F3（编码 TF）表达显著上调，同时 F10、F2R 等多个凝血相关基因表达失调。对 DOCHAS 队列中儿科 IBD 患者直肠活检的 RNA-seq 分析也得到类似结果。进一步研究发现，IBD 患者结肠组织中 CD4+TF+ T 细胞数量明显增加，且从 IBD 患者新鲜结肠活检固有层分离的 CD4+ T 细胞上 TF 表达更高。在 T 细胞转移诱导的结肠炎小鼠模型中，也观察到结肠中 TF 表达上调，且存在 TF+CD3+ T 细胞。
- 活化的炎性 CD4+ T 细胞具有 TF 介导的血栓形成活性：研究人员设计了一种特殊的 CD4+ T 细胞介导的凝血酶生成试验，评估不同 T 细胞亚群的血栓形成活性。结果发现，TCR 激活的辅助性 T 细胞（Th0）和辅助性 T 细胞 1（Th1）促进凝血酶生成的能力显著强于未激活的幼稚 T 细胞（θ），Th17 和诱导调节性 T 细胞（iTregs）也具有增强的促凝特性。通过 FVII 缺陷血浆实验证实，观察到的细胞依赖性凝血酶生成需要因子 VII 参与，且 Th0 和 Th1 细胞上 F3 表达、TF 表面表达和 FXa 生成均显著增加。
- CD4+ T 细胞激活促进细胞表面 TF 解密：在稳态下，大多数免疫细胞表面的 TF 处于 “加密” 状态，只有在损伤、炎症或细胞激活时才会转变为促凝构象。研究发现，T 细胞激活后，Th0 和 Th1 细胞中酸性鞘磷脂酶（ASMase）向细胞表面的转运显著增加，同时磷脂酰丝氨酸（PS）暴露和蛋白二硫键异构酶（PDI）在细胞表面的表达也明显增多，这些都表明 TF 解密机制对 T 细胞激活有响应，支持激活诱导的 TF 表达和随后的解密是 CD4+ T 细胞介导促凝活性的机制基础。
- 儿科 IBD 患者外周血 CD4+ T 细胞具有 TF 依赖的促凝活性：研究人员评估了儿科 IBD 患者和非 IBD 对照人群外周血中分离的 CD4+ T 细胞的 TF 表达和促凝活性。结果显示，IBD 患者外周血中 TF+CD4+ T 细胞数量显著增加，且这些细胞启动凝血酶生成和促进 FXa 生成的能力明显强于健康个体的 T 细胞。
- IBD 中蛋白 C 途径失调并调节 CD4+ T 细胞促凝活性：IBD 患者结肠活检组织中 PC（PROC）基因表达显著降低。活化的 PC 与 Th0 和 Th1 CD4+ T 细胞的结合能力明显强于 θ T 细胞，且能抑制 Th1 和 Th17 分化，促进 Tregs 扩增。活化的 PC 预处理 Th0 和 Th1 细胞可显著降低其促进凝血酶生成的能力，减少 FXa 生成，降低 TF（F3）表达和细胞表面 PDI 水平。此外，研究还发现活化的 PC 可能通过内皮蛋白 C 受体（EPCR）而非蛋白酶激活受体（PAR）激活来降低 T 细胞血栓形成能力。
- 活化的 PC 抑制 IBD 患者外周血 CD4+ T 细胞的促凝活性：研究人员将从 IBD 患者外周血分离的 T 细胞与活化的 PC 孵育后发现，活化的 PC 显著延长了凝血酶生成的滞后时间，减少了峰值和总凝血酶生成，同时降低了 FXa 生成，表明活化的 PC 可直接抑制 TF 介导的 CD4+ T 细胞血栓炎症活性。
研究结论与讨论
在这项研究中，研究人员首次发现 IBD 患者和致结肠炎小鼠的炎症黏膜中存在 TF+CD4+ T 细胞，揭示了活化 CD4+ T 细胞的血栓形成表型，并证明了活化 PC 信号传导在减轻 CD4+ T 细胞血栓炎症活性方面的新作用。
此前的研究虽然发现了 IBD 患者存在凝血失调，但未明确 TF 表达增加的具体细胞来源。而本研究通过多种实验方法证实，适应性免疫 CD4+ T 细胞是 IBD 患者中 TF 的重要来源，且 IBD 患者结肠和外周血中 TF+CD4+ T 细胞数量显著增加。同时，研究还发现 T 细胞激活会导致 TF 解密相关机制激活，这与 T 细胞介导的 IBD 病理生理学的其他方面存在关联。
活化 PC 通常被认为是一种血浆抗凝剂，在本研究中发现它还具有调节 T 细胞免疫血栓形成活性的新功能。这一发现为 IBD 治疗提供了新的思路，即可以开发重组的 “非抗凝” 活化 PC 变体，选择性调节 T 细胞特异性免疫血栓形成活性，而不影响其经典抗凝功能，有望在不增加出血风险的情况下用于治疗 IBD 和其他 T 细胞介导的疾病。
不过，目前研究仍存在一些局限性。虽然在体外实验中对 T 细胞促凝活性和 TF 解密进行了评估，但体内驱动 T 细胞血栓形成性激活的具体炎症和细胞决定因素仍不清楚，需要进一步研究。未来的研究可以围绕这些未知因素展开，深入探索 IBD 与 VTE 之间的关系，为开发更有效的治疗方法提供更坚实的理论基础。
