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为解决分枝杆菌包裹蛋白（encapsulin）组装及货物封装机制不明的问题，马斯特里赫特大学研究人员开展相关研究，利用原位和体外冷冻电镜技术揭示其组装中间体结构。该成果对理解其功能及生物工程应用意义重大，值得科研人员一读。
马斯特里赫特大学（Maastricht University）的研究人员 Casper Berger、Chris Lewis 等人在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “In situ and in vitro cryo-EM reveal structures of mycobacterial encapsulin assembly intermediates” 的论文。该研究在原核生物蛋白质区室（compartment）研究领域意义重大，为深入理解分枝杆菌（Mycobacteriaceae）中包裹蛋白（encapsulin）的组装机制提供了关键信息，有助于推动生物工程和医学研究的发展。
研究背景
细胞过程的区室化对于所有生命领域都至关重要。在真核生物中，复杂的内膜系统（细胞器）的进化促进了区室化；而在原核生物中，存在相对简单的蛋白质区室，即细菌微区室（bacterial microcompartments，BMCs）。包裹蛋白是 BMCs 的一类，其特点是由保守的亚基（Enc）自组装形成，能够包裹具有酶活性的货物蛋白，并且对货物底物保持多孔性 。不同物种的包裹蛋白的亚基数量对应着二十面体的三角剖分数（triangulation，T），目前已报道多种 T 值的包裹蛋白，如在嗜热海栖热袍菌（Thermotoga maritima）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）等物种中为 T=1 ，在黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）中为 T=3 ，在耐热类芽孢杆菌（Quasibacillus thermotolerans）中为 T=4 。虽然完全组装的包裹蛋白外壳的结构已得到很好的描述和表征，但包裹蛋白组装过程中的中间状态，以及它们如何结合货物蛋白等问题仍知之甚少。这是因为此前缺乏中间组装状态的包裹蛋白结构数据，也不清楚这些中间状态是由单体、二聚体、三聚体还是五聚体形成的。包裹蛋白在生物工程和生物医学研究中具有潜在应用价值，更好地了解其组装和货物加载的动态过程，对于充分发挥其功能至关重要。此外，包裹蛋白在细胞内的天然结构信息缺失，而天然结构可能揭示在分离过程中丢失的结合伙伴、中间外壳组装状态以及细胞内加载货物的结构多样性。因此，开展此项研究十分必要。
研究方法
- 原位研究（in situ studies）：研究人员选用海分枝杆菌（M. marinum）进行原位研究，因其生物安全要求较低。先培养海分枝杆菌，在不同培养基中培养并感染人树突状细胞（dendritic cells）。通过冷冻聚焦离子束（cryo-focused ion beam，cryo-FIB）制备薄切片，利用冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography，CET）对其进行观察，从而在天然环境中直接可视化包裹蛋白的结构。
- 体外研究（in vitro studies）：从大肠杆菌（E. coli）中过表达并分离结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的包裹蛋白，该包裹蛋白与海分枝杆菌的包裹蛋白具有较高的序列同一性（92.5%）和相似性（97%） 。通过低 pH 条件使包裹蛋白外壳解聚，再在中性 pH 条件下重新组装，以此研究部分包裹蛋白结构，表征稳定的体外中间组装状态。利用冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM single particle analysis），对重新组装的包裹蛋白进行数据收集和处理，获得不同组装状态下包裹蛋白外壳的结构模型。
研究结果
- 原位海分枝杆菌包裹蛋白结构：研究人员通过 CET 对 217 个倾斜系列进行观察，在感染和未感染的细胞环境中，共识别出 439 个细胞内包裹蛋白。这些包裹蛋白随机分布在细胞中，不与任何细胞特征或膜共定位，且被排除在类核（nucleoids）区域之外。大多数包裹蛋白（>90%）含有货物，部分货物呈小环状密度，外径为 6.9±0.4nm 。许多细胞内包裹蛋白的外壳外部有灵活的尾状延伸结构，有的包裹蛋白有一条尾，有的则有多条。此外，还观察到多种不完整的二十面体包裹蛋白颗粒以及部分含有货物的部分组装包裹蛋白，推测这些是组装或解组装的中间状态。
- 结核分枝杆菌包裹蛋白体外结构：对 89,072 个处于完全组装状态的颗粒进行分析，获得了结核分枝杆菌完全组装包裹蛋白外壳的 2.3 ? 结构。该外壳形成 T=1 的二十面体，内径 19nm，外径 23nm 。通过化学热力学模型预测 Enc-Enc 相互作用的吉布斯自由能（Gibbs free energy），发现二聚体形成的 ΔG 值为 - 14.5 kcal/mol，三聚体为 - 1.0 kcal/mol，五聚体为 0.8 kcal/mol，表明通过 E 环形成 Enc 二聚体在能量上比三聚体中的 Enc 相互作用更有利，而五聚体中的 Enc-Enc 结合在能量上不利。利用 AlphaFold 预测蛋白多聚体形成，也表明二聚体界面在多聚化过程中更受青睐。结核分枝杆菌包裹蛋白外壳有多个不同的孔，如五聚体中心的单孔（直径 9 ?）、三聚体中心的单孔（直径 6 ?）以及五聚体内两个 Enc 亚基界面处的两个孔（直径分别为 9 ? 和 5 ?） ，未在二重对称轴处发现明显的孔。与其他物种相比，其五重对称中心的孔直径相对较大。
- 包裹蛋白外壳的体外稳定中间状态：通过 2D 和 3D（聚焦）分类以及局部对称性分析，确定了包裹蛋白外壳三种不同的稳定中间状态结构，分别为 48 聚体（3,427 个颗粒，分辨率 5.4 ?）、52 聚体（4,378 个颗粒，分辨率 4.5 ?）和 54 聚体（6,294 个颗粒，分辨率 4.6 ?） 。这三种中间状态都具有偶数个单体，外壳一侧封闭，另一侧缺少亚基，整体呈二十面体结构，但 54 聚体与完整包裹蛋白相比，在一个方向上扁平，在垂直方向上拉长。对中间状态包裹蛋白外壳中 Enc 亚基的分辨率分析发现，远离开口处的亚基分辨率更高，更稳定。48 聚体和 52 聚体主要区别在于沿着三重对称轴边缘增加了两个 Enc 二聚体，这增加了先前位于孔边缘的 Enc 亚基的稳定性。
研究结论与讨论
该研究通过体内（in vivo）和体外（in vitro）冷冻电镜相结合的方法，揭示了分枝杆菌包裹蛋白的结构异质性。原位研究观察到包裹蛋白具有异质货物、部分组装（或解组装）状态以及之前未描述的尾状延伸结构；体外研究获得了完全组装包裹蛋白外壳的高分辨率结构，以及部分组装或解组装状态下的三种中间结构模型。对中间状态结构的分析表明，包裹蛋白主要由 Enc 二聚体组装而成，而非三聚体或五聚体。
细胞内包裹蛋白货物外观异质，包括直径 6.9nm 的环状货物和看似空的包裹蛋白，虽然无法明确环状货物的身份，但推测 DyP 和 FolB 可能是候选者。部分包裹蛋白外壳内有货物，支持了货物蛋白在组装过程中加载到外壳中的假设，同时也暗示了可能存在促进货物蛋白包裹的调控机制。包裹蛋白上的尾状延伸结构在分离的包裹蛋白中不存在，其功能和组成蛋白有待进一步研究。体内外观察到的不同组装状态，表明包裹过程在细胞内是一个高度动态的过程。
结核分枝杆菌包裹蛋白外壳的高分辨率体外结构，丰富了对不同细菌物种包裹蛋白结构的认识。与其他物种的 T=1 包裹蛋白相比，其结构存在一些差异，如缺乏 M. hassiacum 中存在的二硫键，五重对称处的孔较大等。这些差异可能与不同的功能特性相关。研究中通过降低 pH 获得的中间结构，虽然在一定程度上模拟了包裹蛋白的组装和解组装过程，但与细胞内条件可能存在差异。不过，高分辨率的结构以及与其他非 pH 依赖的解聚和重聚获得的包裹蛋白结构的高度同源性，支持了该过程的可逆性。
基于研究结果，研究人员提出了包裹蛋白组装模型：成核事件引发多聚体的形成，货物蛋白可能在组装过程中掺入。由于中间结构仅一侧开放，推测包裹蛋白主要从一侧向另一侧组装，边缘作为支架。Enc 亚基主要通过 E 环形成二聚体，因此包裹蛋白外壳主要由二聚体或在组装过程中迅速二聚化的单体组装而成。
该研究对包裹蛋白组装机制的深入了解，有助于进一步研究其在细胞内的功能，以及作为毒力因子的作用。同时，为将包裹蛋白外壳开发为生物工程工具提供了理论基础，如在生物催化、药物递送等领域具有潜在应用价值。此外，研究中展示的结构异质性强调了在天然细胞环境和分离状态下研究动态蛋白质组装的重要性，随着原位结构生物学和单颗粒分析（SPA）技术的不断发展，有望更深入地了解各种大分子的结构景观及其与细胞功能的关系。
