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为解决 ccRCC 发病机制及性别差异相关问题，德国弗莱堡大学的研究人员开展 KDM5C 和 KDM5D 突变研究，发现二者在 ccRCC 细胞中功能有差异，且与 Y 染色体缺失有关。这对理解 ccRCC 发病机制和开发新疗法意义重大，值得科研读者一读。
德国弗莱堡大学医学中心内科血液学、肿瘤学和干细胞移植系（Department of Internal Medicine I, Hematology, Oncology and Stem Cell Transplantation, Faculty of Medicine, Medical Center-University of Freiburg）的 Marvin Müller、Kyra Zodel 等研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “KDM5C and KDM5D mutations have different consequences in clear cell renal cell carcinoma cells” 的论文。这篇论文在肾癌研究领域意义重大，为深入理解透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的发病机制以及性别差异在其中的作用提供了新的视角，有望为肾癌的精准治疗开辟新方向。
研究背景
透明细胞肾细胞癌是成人中常见的肾脏恶性肿瘤，占所有肾恶性肿瘤的 70 - 80%，也是成人十大常见肿瘤之一。它具有独特的突变谱，被认为是一种由表观遗传驱动的肿瘤。在肿瘤形成过程中，82 - 92% 的 ccRCC 原发性肿瘤会出现冯?希佩尔 - 林道（von Hippel–Lindau，VHL）肿瘤抑制基因的双等位基因失活，这会导致一系列组蛋白去甲基化酶的转录上调，包括 KDM3A、KDM4B、KDM5C 和 KDM6B 等，表明组蛋白 H3 甲基化的各种改变是肿瘤形成过程中的早期事件。
在 ccRCC 的发展过程中，细胞还会积累其他表观遗传调控基因的突变，其中就包括 KDM5C。KDM5C 编码一种组蛋白 H3 - 赖氨酸 4（H3K4）二甲基 / 三甲基去甲基化酶，在 ccRCC 中，KDM5C 突变在男性患者中更为常见，而女性相对较少。有趣的是，Y 染色体上的 KDM5D 基因编码的蛋白与 KDM5C 具有高度相似性，二者在体外实验中都能将二甲基化和三甲基化的 H3K4 转化为单甲基化形式。通常认为，在女性细胞中，两个表达的 KDM5C 等位基因对正常细胞功能至关重要；而在男性细胞中，Y 染色体编码的 KDM5D 被认为可作为替代的第二个等位基因，补充 X 染色体编码的 KDM5C 等位基因的功能。但令人困惑的是，KDM5C 在男性癌症患者（包括 ccRCC）中的突变频率高于女性，且 30 - 40% 的男性 ccRCC 患者会出现 Y 染色体缺失，这其中就包括 KDM5D 基因的缺失。这种性别差异背后的分子机制尚不清楚，因此，研究人员开展了此项研究，旨在探究 KDM5C 和 KDM5D 突变在 ccRCC 细胞中的作用及二者之间的关系。
研究方法
- 细胞培养与基因编辑：研究人员选用了 786 - O、769 - P、A498、RCC4、SLR22 等多种 ccRCC 细胞系以及人原发性肾近端小管上皮细胞（RPTEC）。利用 MuLE 慢病毒载体，通过 CRISPR - Cas9 技术对细胞系中的 KDM5C 和 KDM5D 基因进行编辑，构建了不同突变类型的细胞株，为后续研究提供了实验材料。
- 蛋白检测：运用蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术，使用抗 KDM5C、抗 KDM5D 和抗 Vinculin 等抗体，检测细胞中 KDM5C 和 KDM5D 蛋白的表达水平，直观呈现基因编辑对蛋白表达的影响。
- 细胞功能检测：采用增殖实验、软琼脂集落形成实验和异种移植肿瘤生长实验，分别评估细胞的增殖能力、锚定非依赖性生长能力以及在体内形成肿瘤的能力，从多个角度探究基因编辑后细胞行为的变化。
- 基因表达分析：借助 RNA 测序（RNA - seq）技术，对不同突变类型的细胞进行转录组分析，筛选出差异表达基因，深入了解基因表达谱的变化。同时，运用 CUT&RUN 技术，研究 KDM5C 和 KDM5D 在基因组上的结合位点，以及这些位点与组蛋白修饰的关系，进一步揭示基因调控的机制。
- 数据分析：对 TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中的 KIRC（Kidney renal clear cell carcinoma）数据进行挖掘，分析 KDM5C 突变与 Y 染色体基因表达之间的关联，从临床大数据层面验证实验结果。在统计分析中，使用了双侧 Student's 非配对 t 检验、Welch 校正以及单因素方差分析（one - way ANOVA）和 Dunnett 多重比较检验等方法，确保实验结果的准确性和可靠性。
研究结果
- KDM5C 突变对不同 ccRCC 细胞系癌细胞行为的影响各异：研究人员通过 CRISPR - Cas9 诱变技术，在多个 ccRCC 细胞系中引入 KDM5C 突变。结果发现，KDM5C 突变对不同细胞系的增殖、软琼脂集落形成和异种移植肿瘤生长等方面的影响各不相同。在 786 - O 细胞中，KDM5C 突变不影响增殖和异种移植肿瘤形成；在 CAKI - 2 细胞中，突变减缓了异种移植肿瘤的生长；而在 A498 和 769 - P 细胞中，KDM5C 突变分别促进和抑制了异种移植肿瘤的生长。这表明 KDM5C 突变对 ccRCC 癌细胞行为的影响具有细胞系特异性。
- KDM5C 突变在不同 ccRCC 细胞系中引起非重叠的转录变化：对 KDM5C 突变的细胞系进行 RNA - seq 分析，发现与对照组相比，各细胞系中 KDM5C 突变细胞的转录变化较为温和，且不同细胞系之间差异调节的基因几乎没有重叠。进一步研究发现，KDM5C 的结合位点在不同细胞系中也存在差异，其结合与基因表达的变化并无明显关联。在 A498 细胞中，尽管 KDM5C 结合的区域具有特定的组蛋白修饰模式，但大部分差异表达基因的启动子和增强子并未检测到 KDM5C 的结合，这说明 KDM5C 可能并非通过直接结合启动子和增强子来调控基因表达。
- KDM5C 和 KDM5D 在 786 - O ccRCC 细胞中功能不同：分析 TCGA 数据发现，男性 ccRCC 肿瘤中 KDM5C 突变常与 Y 染色体基因表达水平降低相关，这意味着 Y 染色体缺失。研究人员选用 786 - O 细胞系，构建了 KDM5C 和 KDM5D 单突变及双突变细胞株。结果显示，单突变和双突变细胞在正常培养条件下增殖能力相当，但双突变细胞在软琼脂中形成更多集落。在异种移植实验中，KDM5D 突变细胞无法形成肿瘤，而 KDM5C 和 KDM5D 共突变则恢复了肿瘤形成能力，且 KDM5D 突变似乎还恢复了 KDM5C 突变细胞的转移能力，这表明 KDM5C 和 KDM5D 在 786 - O 细胞中的功能既存在重叠又有所不同。
- KDM5C 和 KDM5D 对 786 - O ccRCC 细胞基因表达的影响不同：对 786 - O 细胞的突变体进行 RNA - seq 分析，发现 KDM5C 和 KDM5D 单突变虽然共享部分上调和下调基因，但大部分差异表达基因是各自特有的。KDM5C 突变特异性上调的基因包括缺氧靶点和细胞间信号传导相关基因，同时下调一些发育相关基因；KDM5D 突变特异性上调的基因参与上皮 - 间质转化、干扰素反应等过程，且包含多个潜在的肿瘤抑制基因，同时下调一些细胞间信号传导相关基因。KDM5C 和 KDM5D 共突变时，基因表达变化更为复杂，这进一步证实了二者在基因调控方面的差异。
- KDM5C 和 KDM5D 不结合差异表达基因的启动子和增强子：通过 CUT&RUN 实验发现，KDM5C 和 KDM5D 在 786 - O 细胞中的结合位点有一定重叠，且大部分重叠位点与 H3K4me1 信号共定位。然而，无论是 KDM5C 还是 KDM5D 突变，都不会影响这些结合位点处 H3K4me1 的水平。对差异表达基因的启动子和增强子分析发现，KDM5C 和 KDM5D 均不结合这些位点，这表明它们调控基因表达的机制不同于以往在其他细胞中提出的 KDM5 酶家族基因调控模型。
研究结论与讨论
本研究深入探讨了 KDM5C 和 KDM5D 突变在 ccRCC 细胞中的作用及二者之间的关系，发现 KDM5C 突变在 ccRCC 细胞系中对癌细胞行为和基因表达的影响具有细胞系特异性，且 KDM5C 和 KDM5D 在 786 - O 细胞中的功能既重叠又有差异。这些结果挑战了传统观点，即认为男性细胞中的 KDM5D 与女性细胞中的第二个 KDM5C 等位基因功能等效。同时，研究还揭示了 KDM5C 突变与 Y 染色体缺失在男性 ccRCC 发展过程中的相互作用，为理解 ccRCC 的发病机制提供了新的思路。
从临床角度来看，本研究有助于解释 ccRCC 在男性和女性中发病率和生物学行为差异的潜在机制。Y 染色体缺失在男性 ccRCC 肿瘤中并非偶然事件，它与 KDM5C 突变相互影响，共同推动肿瘤的发展。此外，研究中发现 KDM5D 突变细胞中干扰素反应相关基因上调，而 KDM5C 共突变可消除这种上调，这提示在免疫治疗方面，KDM5C 和 Y 染色体状态可能影响 ccRCC 肿瘤的免疫微环境，为 ccRCC 的免疫治疗提供了新的潜在靶点和研究方向。
然而，目前仍有许多问题有待进一步研究。例如，在其他男性 ccRCC 细胞系中，是否也存在类似的 KDM5C 和 KDM5D 突变关系？Y 染色体缺失是否完全等同于 KDM5D 突变，Y 染色体上的其他肿瘤抑制基因在这一过程中又发挥着怎样的作用？这些问题的解答将进一步完善对 ccRCC 发病机制的认识，为开发更有效的治疗策略提供坚实的理论基础。
总的来说，该研究成果为 ccRCC 的研究开辟了新的方向，有助于推动肾癌治疗从传统模式向精准治疗转变，具有重要的理论和临床价值，有望为肾癌患者带来更好的治疗前景。
