重磅发现！CPT1A 介导 MFF 琥珀酰化维持卵巢癌干细胞干性的全新机制及治疗新靶点探索

为解决卵巢癌治疗难题，陕西师范大学的研究人员开展 CPT1A 对卵巢癌干细胞（OCSCs）干性维持机制的研究。发现 CPT1A 可促进 MFF 琥珀酰化维持 OCSCs 干性，抑制其活性能增强顺铂疗效。该成果为卵巢癌治疗提供新靶点，值得科研人员一读。

　　

陕西师范大学生命科学学院的研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “CPT1A-mediated MFF succinylation promotes stemness maintenance in ovarian cancer stem cells” 的论文。这一研究成果在卵巢癌治疗领域意义重大，为深入理解卵巢癌干细胞（OCSCs）干性维持机制，以及开发新的治疗策略提供了关键线索。

论文摘要指出，癌症干细胞（CSCs）在癌症进展、免疫逃逸、耐药性和复发中起着关键作用。该研究发现肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）在卵巢癌干细胞中高表达，且对维持其干性至关重要。CPT1A 通过调节脂质去饱和，促进线粒体裂变因子（MFF）的琥珀酰化，进而影响线粒体相关膜（MAMs）的形成和 SREBP1/SCD1 信号轴的激活。抑制 CPT1A 的赖氨酸琥珀酰转移酶（LSTase）活性，可降低 OCSCs 的干性，并增强顺铂的抗肿瘤效果。

癌症干细胞（CSCs）是肿瘤细胞中的一小部分具有自我更新和多能分化能力的细胞，它们能在体内引发肿瘤，并且对放疗和化疗具有高度抗性，还可通过上皮 - 间质转化（EMT）和免疫逃逸导致肿瘤转移。因此，针对 CSCs 的研究对提高肿瘤治疗效果至关重要。干细胞维持干性的机制十分复杂，涉及 Wnt、Notch、Hedgehog 和 PI3K/Akt 等关键信号通路，以及 CD133、CD44 和 ALDH1A1 等干细胞标志物的表达。近年来研究发现，脂质去饱和在 CSCs 干性维持中也起着关键作用，尤其是在卵巢癌干细胞（OCSCs）中，已被视为一种代谢标志物和潜在治疗靶点。

肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）是位于线粒体外膜的关键酶，参与调节长链脂肪酸进入线粒体进行氧化降解。已有研究表明，CPT1A 参与 EMT 和肿瘤细胞迁移等过程，并且与胚胎和成年神经干细胞的干性维持和分化密切相关，但它调控干细胞干性维持的具体机制尚不完全清楚。此外，CPT1A 具有赖氨酸琥珀酰转移酶（LSTase）活性，可促进细胞内的琥珀酰化修饰。

线粒体相关膜（MAMs）由线粒体和内质网紧密相互作用形成，在多种疾病中发挥重要作用。MAMs 富含癌基因，参与其形成的蛋白质与肿瘤发生和干细胞干性维持相关，但 MAMs 维持干细胞干性的调控机制仍有待进一步研究。硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 - 1（SCD1）是将饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的关键限速酶，在多种癌症的干细胞干性维持中起重要作用，抑制 SCD1 可显著降低癌细胞耐药性并阻碍肿瘤进展，但调控 CSCs 中 SCD1 表达的机制尚需深入探索。

为深入探究 CPT1A 在卵巢癌干细胞干性维持中的作用，研究人员采用了多种先进技术方法。在细胞培养方面，对人 SKOV3、A2780 等多种细胞进行培养，通过筛选确定合适的 CSCs 培养基和培养条件，利用悬浮球培养法获取 OCSCs。运用质粒构建和慢病毒包装技术，构建 shRNA 慢病毒载体实现基因敲低，构建 pCDH - CMV 载体实现基因过表达，同时构建突变体进行功能研究。

通过蛋白质免疫印迹（Western blot）、抗体检测和免疫组织化学（IHC）染色，检测相关蛋白的表达水平；利用免疫荧光和共聚焦显微镜技术，观察蛋白的定位和细胞内的相互作用；采用实时荧光定量 PCR（Real - time PCR）测定基因的 mRNA 水平。借助细胞活力检测（MTT 法）、划痕愈合实验和 Transwell 实验，研究细胞的增殖、迁移和侵袭能力；运用透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构，包括 MAMs 的形态和数量变化。

构建裸鼠皮下肿瘤模型，研究药物在体内的抗肿瘤效果；通过流式细胞术分析和细胞分选，对特定细胞群体进行分析和筛选；利用球形成实验评估 OCSCs 的干性；采用液相色谱 - 质谱联用技术（LC - MS/MS）进行脂质组学和蛋白质组学分析，研究脂质代谢和蛋白质表达变化；运用 RNA 测序（RNA - seq）分析基因表达谱的改变；通过亚细胞分级分离技术，分离不同亚细胞组分进行研究；使用总胆固醇分析试剂盒和琥珀酰辅酶 A 检测试剂盒，测定细胞内胆固醇和琥珀酰辅酶 A 的含量。

CPT1A 在卵巢癌干细胞中高表达

研究人员通过球形成实验，比较不同培养基和培养条件下细胞的成球效率，确定了最适的 CSCs 培养基和培养参数。对多种卵巢癌细胞和正常卵巢细胞进行悬浮球培养，发现只有卵巢癌细胞能形成球体，其中 A2780 和 SKOV3 细胞成球效率最高，后续实验以此为模型。

通过蛋白质谱分析、Western blot、流式细胞术和免疫荧光等实验，发现 CPT1A 在 OCSCs 中显著高表达，且与干细胞标志物 CD133、ALDH1A1 存在共定位现象。这表明 CPT1A 与卵巢癌干细胞的干性密切相关，为后续研究其功能奠定了基础。

CPT1A 维持卵巢癌干细胞干性

在卵巢癌细胞 A2780 和 SKOV3 中沉默 CPT1A 后，研究人员发现干细胞标志物表达显著降低，球形成实验显示球体形成数量和大小均受到抑制，且传代过程中干细胞球的成球能力也明显受阻。

通过流式细胞术分析发现，CPT1A 敲低后，CD133 阳性细胞群体显著减少。进一步研究发现，降低 CPT1A 会抑制 OCSCs 的对称分裂，增加分化标记物的表达，同时抑制 EMT 过程，降低细胞的迁移和侵袭能力，并且提高卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。这些结果表明，CPT1A 在维持卵巢癌干细胞干性、抑制细胞分化和促进肿瘤耐药方面发挥着关键作用。

CPT1A 通过调节脂质去饱和促进干细胞干性维持

对 CPT1A 敲低的 SKOV3 细胞进行 RNA - seq 数据分析，发现基因表达谱发生显著变化，KEGG 分析表明与干细胞相关的通路和脂质代谢通路显著富集，尤其是不饱和脂肪酸代谢相关基因。脂质组学分析显示，CPT1A 敲低后，细胞内单不饱和脂肪酸水平下降，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例降低。

向 CPT1A 敲低的 SKOV3 细胞中引入棕榈油酸（16C）或油酸（18C）后，干细胞球的数量和大小显著增加，干细胞标志物表达恢复，细胞对称分裂能力也得到恢复。这表明 CPT1A 可能通过影响 16C 和 18C 单不饱和脂肪酸的产生来维持 OCSCs 的干性。

CPT1A 激活 SREBP1 促进 SCD1 表达

RNA - seq 数据分析显示，CPT1A 敲低导致 SCD1 表达显著下调。在卵巢癌细胞中对 SCD1 进行敲低或过表达实验，发现 SCD1 对 OCSCs 标志物表达和球形成能力有显著影响。恢复 CPT1A 敲低细胞中的 SCD1 表达，可逆转因 CPT1A 敲低导致的 OCSCs 标志物下降和球形成能力降低的现象。

研究发现，CPT1A 可通过调节 SREBP1 的激活来调控 SCD1 的表达。敲低 CPT1A 会减少 SREBP1 的激活和核转位，而引入 SREBP1 抑制剂 Fatostatin A 可抑制 CPT1A 过表达诱导的 SCD1 表达增加。这些结果表明，CPT1A 通过激活 SREBP1 促进 SCD1 表达，进而维持 OCSCs 的干性。

CPT1A 通过调节 MAMs 激活 SREBP1

研究发现，CPT1A 敲低会导致细胞内胆固醇水平升高，而 MAMs 在胆固醇运输中起关键作用。引入 MAMs - Linker 增强 MAMs 形成后，SREBP1 激活增加；敲低 MAMs 形成相关蛋白 FUNDC1 或 VDAC1，会减少 SREBP1 激活。

CPT1A 敲低会减少 MAMs 的形成，而过表达 CPT1A 则会增加 MAMs。补充 MAMs 可恢复因 CPT1A 敲低导致的 SREBP1 激活、SCD1 表达和干细胞标志物表达的下降。这表明 CPT1A 通过调节 MAMs 的形成来影响 SREBP1/SCD1 轴，进而维持 OCSCs 的干性。

CPT1A 通过 MFF 调节 MAMs 和 SREBP1/SCD1 轴维持干性

研究人员发现，CPT1A 与 MFF 相互作用并增强其表达，MFF 定位于 MAMs。敲低 MFF 会减少 MAMs 的形成，而过表达 MFF 可恢复因 CPT1A 敲低导致的 MAMs 形成减少的现象。

敲低 MFF 会降低 SREBP1 激活和 SCD1 表达，而过表达 MFF 可恢复这些变化，且加入 Fatostatin A 可再次抑制 SCD1 表达。敲低 MFF 会降低 OCSCs 标志物表达和球形成能力，而过表达 MFF 则可恢复这些能力。这表明 CPT1A 通过调节 MFF 影响 MAMs 的形成，进而调控 SREBP1/SCD1 信号轴，维持 OCSCs 的干性。

succK - MFF 在 CPT1A 调节 MAMs 和 SREBP1/SCD1 激活维持干性中的关键作用

CPT1A 作为赖氨酸琥珀酰转移酶，可促进 MFF 的琥珀酰化，稳定 MFF 表达。succK - MFF 主要存在于 MAMs 中，过表达具有 LSTase 活性的 CPT1A - G710E 可恢复卵巢癌细胞的球形成能力、干细胞标志物表达和 SREBP1/SCD1 激活，而缺乏 LSTase 活性的 CPT1A - H473A 则无此作用。

使用 sirt5 激活剂（VPA）或 CPT1A 抑制剂（ETO 和 Glyburide）处理 SKOV3 细胞，发现 Glyburide 可显著抑制 MFF 的琥珀酰化修饰、MAMs 的形成、SCD1 和干细胞标志物的表达，降低卵巢癌细胞的球形成能力和对称分裂能力。这表明 succK - MFF 在 CPT1A 调节 MAMs、影响 SREBP1/SCD1 激活和维持 OCSCs 干性中起关键作用。

抑制 CPT1A LSTase 活性增强顺铂抗肿瘤效果

卵巢癌常因存在 CSCs 而对铂类化疗耐药。研究发现，Glyburide 可增强顺铂对卵巢癌细胞的抑制作用，降低干细胞标志物表达。在裸鼠皮下肿瘤模型中，Glyburide 和顺铂联合治疗显著抑制肿瘤生长，且对小鼠体重无明显影响。

对肿瘤组织进行 Western blot 和免疫组化分析发现，联合治疗可显著抑制干细胞标志物、SCD1、succK - MFF 和 Ki67 的表达，同时上调分化标记物 TUBB3 和 α - SMA 的表达。这表明抑制 CPT1A 的 LSTase 活性可降低 OCSCs 干性，增强顺铂的抗肿瘤效果。

研究表明，CPT1A 通过其 LSTase 活性促进 MFF 的琥珀酰化修饰，调节 MAMs 的形成，进而激活 SREBP1/SCD1 信号通路，维持卵巢癌干细胞的干性。抑制 CPT1A 的 LSTase 活性，如使用 Glyburide，可有效降低 OCSCs 的干性，增强化疗药物顺铂的抗肿瘤效果。这一发现揭示了卵巢癌干细胞干性维持的新机制，为卵巢癌的治疗提供了潜在的新靶点和治疗策略，有望改善卵巢癌患者的治疗效果，具有重要的临床意义。

然而，该研究也存在一些有待进一步探索的问题。虽然明确了 CPT1A - MFF - MAMs - SREBP1/SCD1 轴在维持 OCSCs 干性中的重要作用，但 MAMs 影响 SREBP1 转位和活性的具体机制仍不清楚，MFF 是否直接促进 SREBP1 转位也需进一步研究。此外，Glyburide 抑制 CPT1A 的 LSTase 活性的精确分子机制尚未明确。未来研究可针对这些问题深入探究，为卵巢癌的治疗提供更深入的理论基础和更有效的治疗方案。