人类唯一能存活的染色体单体核型（45,X）转录组全景解析

为探究特纳综合征（TS）发病机制及 X 单体（45,X）妊娠流产原因，伦敦大学学院研究人员开展 45,X 胎儿及胎盘转录组研究。发现相关基因表达变化，明确 CSF2RA 在胎盘的作用。该研究为 TS 研究提供关键依据，值得科研人员一读。

　　

伦敦大学学院大奥蒙德街儿童健康研究所（UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London）的 Jenifer P. Suntharalingham 等人在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “The transcriptomic landscape of monosomy X (45,X) during early human fetal and placental development” 的论文。这篇论文在性染色体生物学、特纳综合征（Turner syndrome，TS）发病机制研究以及相关疾病潜在治疗靶点探索等领域具有重要意义，为后续深入研究提供了关键的理论依据和方向指引。

研究背景

特纳综合征（TS）与人类第二条 X 染色体的全部或部分缺失有关，大约每 2500 名女性中就有 1 人患病 。其中，约 50% 的 TS 患者核型为 X 单体（45,X），不过也存在其他核型变异。虽然 45,X 是人类唯一能存活的染色体单体核型，但多数 45,X 胎儿无法足月出生，很多在孕早期或孕中期早期就自然流产，常在孕妇意识到怀孕前就已发生。

患有 TS/45,X 核型的女孩和年轻女性会在不同年龄段出现多种症状。新生儿期，可能因淋巴水肿、先天性心血管异常（如主动脉缩窄）、肾脏问题（如马蹄肾）或特殊体征（如宽胸、颈部皮肤增宽）等被怀疑患病，也有短暂性高胰岛素血症和低血糖的报告。儿童期，早期症状包括生长发育迟缓、反复中耳炎；青少年时期则会出现青春期缺失和原发性卵巢功能不全。成年后，患糖尿病、体重增加、高血压、肝酶升高、听力障碍、甲状腺功能减退、自身免疫性疾病、心血管疾病和皮肤痣等长期合并症的风险更高，主动脉根部扩张和夹层还会导致 TS 女性的总体死亡率上升 。

目前，TS 临床特征的潜在机制尚不清楚。虽然普遍认为其与第二条性染色体的缺失相关，如假常染色体区域（PAR）基因的单倍体不足、X 染色体失活逃逸基因的剂量减少等，但这些复杂的相互作用仍需深入研究。此前，多数关于 TS 致病基础的转录组研究集中在血液白细胞或外周血单核细胞，对与 TS 表型密切相关组织的研究较少，且成年组织的生化和转录组特征易受多种因素影响，难以评估 “纯粹” 的 45,X 转录组 。鉴于许多 TS 相关临床特征在出生后早期就已出现，且成年期疾病的根源可能部分在胚胎或胎儿发育阶段就已奠定，研究人员开展了此项针对 45,X 胎儿样本的详细转录组分析。

研究方法

1. 样本采集：研究使用的人类胎儿组织样本来自医学研究委员会（MRC）/ 惠康基金会资助的人类发育生物学资源库（HDBR），在获取样本时已获得知情同意和伦理批准。样本于选择性终止妊娠后采集，通过测量胎儿的足长和膝跟长度来估算胎龄，利用定量 PCR 和阵列分析确定胎儿核型。研究选取了胰腺、肝脏、肾脏、皮肤等组织，以及由脑、脾、肺、心组成的混合组织样本，同时采集了胎盘样本。每个测序组包含 4 个 45,X 样本，以及 4 个年龄和组织匹配的 46,XX 和 46,XY 对照样本。对于胎盘研究，还采集了 6 个 45,X 胎盘样本，以及 6 个年龄匹配的 46,XX 和 46,XY 对照胎盘样本 。

2. RNA/DNA 提取：从 - 70°C 储存的样本中取出，必要时进行进一步解剖，使用 Qiagen 的 AllPrep DNA/RNA Mini Kit 按照制造商的方案提取 RNA 和 DNA 。通过 Tapestation 4200 平台评估 RNA 质量，用 NanoDrop 分光光度计对 DNA 进行定量 。

3. SNP 阵列分析：对提取的 DNA 样本进行 SNP 阵列分析，采用 Illumina Global Screening Array 平台（v3.0），使用 Conlin 等人描述的方法评估 X 染色体嵌合情况 。

4. 批量 RNA 文库制备和测序：利用 KAPA mRNA HyperPrep Kit 在 Hamilton Starlet 机器人平台上从 RNA 生成 cDNA 文库，在 NovaSeq S2 Flowcell（配对末端 2x56bp）上进行测序 。测序产生的 Fastq 文件通过 FastQC 处理，然后使用 STAR 软件比对到人类基因组（Ensembl, GRCh 38.86），用 R 包 Subread 中的 featureCounts 生成包含唯一映射读数计数的矩阵 。

5. 数据分析和可视化：使用 R（版本 4.2.2）进行数据分析。通过主成分分析（PCA）比较 RNA 测序样本的维度，使用 DESeq2 进行与核型相关的组织差异表达分析，还用 limma-voom 中的线性混合效应模型进行多组织线性分析。利用 ggplot2 生成火山图、小提琴图，用 pheatmap 库生成热图，通过 Venny 2.1 或 InteractiVenn 进行 Venn 图分析，使用 clusterProfiler、Metascape 和 gProfiler 进行通路分析和富集分析 。

6. 其他实验：对 OVCH1-AS1 基因座进行生物信息学分析，使用定量实时 PCR（qRT-PCR）验证相关基因的表达，对胎盘样本进行免疫组织化学（IHC）染色分析 CSF2RA 的表达和定位 。

研究结果

1. 全局转录组差异和关键性染色体基因：对 45,X 胎儿样本（n=20）、46,XX（n=20）和 46,XY（n=20）对照样本进行批量 RNA 测序。PCA 分析显示，整体数据集样本主要按组织来源聚类，不过在胰腺和肝脏等组织中，核型对聚类有影响 。热图展示了关键性染色体基因的表达情况，如 XIST 在 46,XX 组织中强表达，在 46,XY 和 45,X 样本中不表达；Y 染色体基因在 46,XY 样本中强表达，在 46,XX 和 45,X 样本中不表达（除两个嵌合样本有低水平表达） 。

2. 45,X 组织中表达较低的基因：通过差异基因表达（DGE）分析，研究人员发现一些基因在 45,X 组织中的表达低于对照组。最初分析聚焦于在 45,X 与 46,XX、45,X 与 46,XY 数据集中均表达较低且在五种组织中一致的基因（log?FC < -0.5，调整后 p 值 < 0.05），虽未发现所有组织共有的基因，但多个组织中 SLC25A6、AKAP17A 等基因在 45,X 组织中表达较低，这些基因位于 PAR1 区域 。进一步研究发现，许多 PAR1 基因在 45,X 组织中的表达低于对照组，但部分 PAR1 基因和 PAR2 区域基因未显示明显差异表达 。除 PAR 基因外，组蛋白去甲基化酶基因 KDM5C 和 KDM6A 在 45,X 组织中的表达低于 46,XX 对照组织，可能与 X 失活逃逸有关 。研究人员还分析了同源的祖先 X-Y 基因对，发现多数 X-Y 基因对在 45,X 组织中的表达降低 。此外，研究还鉴定出一些在 45,X 组织中表达较低的常染色体基因和其他 X 染色体基因，通路富集分析显示这些基因与升主动脉瘤、结缔组织疾病等相关 。

3. 45,X 组织中表达较高的基因：研究人员也关注了在 45,X 组织中表达高于对照组的基因。通过组织特异性分析，发现只有 OVCH1 Antisense RNA 1（OVCH1-AS1）在所有组织中均表现出在 45,X 组织中高表达的特征 。OVCH1-AS1 是位于 12 号染色体上的长链非编码 RNA（lncRNA），目前对其功能了解较少 。研究人员对其基因座及周围基因进行分析，未发现对周围基因表达有明显影响，其在人类中的功能仍有待进一步研究 。

4. 多组织分析：考虑到单个组织样本量较小，研究人员进行了多组织分析，将胰腺、肝脏、肾脏、皮肤和混合组织数据合并（每组核型 n=20） 。多组织分析鉴定出在 45,X 组织中一致低表达（如 AKAP17A1、ASMTL 等）或高表达（如 OVCH1-ASI、PAEP）的基因，通过相关性分析和线性混合效应模型进一步验证了结果 。

5. X 单体与发育中的胎盘：多数 45,X 妊娠会流产，可能与胎盘发育和功能缺陷有关。研究人员对 11 - 15 周的 45,X 胎盘样本（n=6）和匹配的对照胎盘样本进行分析 。SNP 阵列分析未发现 45,X 胎盘存在显著的 46,XX 细胞系嵌合现象 。转录组分析显示，45,X 胎盘的 CSF2RA 基因表达低于对照组，免疫组化结果表明其在 14 周时的定位和表达模式存在差异 。通路富集分析发现，45,X 胎盘低表达基因与白细胞激活、免疫反应和细胞因子信号传导等过程相关，提示免疫和炎症过程的失调可能导致胎盘功能障碍 。

研究结论与讨论

这项研究首次对人类 45,X 胎儿相关组织（胰腺、肾脏、肝脏、皮肤和胎盘）进行了详细的转录组分析，揭示了许多重要信息 。在基因表达方面，研究发现 45,X 组织中 PAR1 区域许多基因表达降低，PAR2 区域基因表达无差异；KDM5C、KDM6A 等 X 失活逃逸基因及多个祖先 X-Y 基因对表达降低，这可能影响转录、翻译和组蛋白甲基化等过程，进而影响胎儿发育 。此外，研究还发现一些常染色体基因如 LDLR 表达降低，可能与 TS 患者的血脂异常等疾病风险相关；而在 45,X 组织中唯一高表达的基因 OVCH1-AS1，其功能虽不明确，但可能在人类 45,X 相关表型中发挥独特作用 。

在胎盘研究方面，研究人员未发现 45,X 胎盘有显著的 46,XX 嵌合现象，表明这可能不是胎儿存活的常见机制 。而 CSF2RA 在 45,X 胎盘表达降低，结合其在免疫调节中的作用及胎盘的病理变化，说明其可能是 45,X 妊娠胎盘功能障碍的关键调节因子，为理解妊娠丢失机制提供了新视角 。

不过，该研究也存在一定局限性，如样本数量有限、样本采集时间窗口较窄、存在一个胎儿 Y 染色体低水平嵌合现象、未采用单细胞 RNA 测序等 。但研究人员通过精心设计实验、多组织分析等方法，在一定程度上弥补了这些不足 。

总的来说，这项研究为性染色体生物学提供了重要数据，有助于深入理解 TS 的发病机制，为未来开发针对 TS 患者的个性化治疗策略提供了潜在靶点和理论基础，对推动相关领域的研究具有重要意义 。