组织蛋白酶 B 通过降解病理性淀粉样原纤维预防细胞死亡的关键机制解析

为解决抗淀粉样治疗难题，俄罗斯科学院细胞学研究所研究人员开展 CTSB 对多种疾病相关淀粉样纤维影响的研究。结果发现 CTSB 能降解纤维并降低毒性。该研究为理解疾病机制和开发新疗法提供依据，值得科研人员一读。

　　

俄罗斯科学院细胞学研究所（Institute of Cytology Russian Academy of Sciences）的研究人员 Maksim I. Sulatsky、Olesya V. Stepanenko 等人在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “Cathepsin B prevents cell death by fragmentation and destruction of pathological amyloid fibrils” 的论文。这篇论文在神经病理学以及抗淀粉样蛋白治疗药物研发领域意义重大，为深入理解内源性组织蛋白酶 B（Cathepsin B，CTSB）在不同神经病理中对淀粉样蛋白的调控机制提供了关键线索，也为开发安全有效的抗淀粉样蛋白药物指明了新方向。

研究背景

淀粉样纤维（amyloid fibrils）在多种严重疾病中大量积累，会导致器官和组织功能障碍。以帕金森病和阿尔茨海默病为例，帕金森病患者大脑中会形成由 α - 突触核蛋白（alpha - synuclein）构成的致病性淀粉样蛋白，全球约有 610 万患者；阿尔茨海默病则以大脑中 β 淀粉样蛋白（1 - 42）（abeta peptide (1 - 42)）斑块的积累为特征，目前全球已有 4380 万人患病，预计到 2050 年将激增至 1.52 亿人，被世界卫生组织称为 “21 世纪的流行病” 。此外，还有血液透析淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性等疾病，都与淀粉样纤维的异常积累密切相关。

尽管淀粉样变性疾病普遍且严重，但目前仍缺乏安全有效的抗淀粉样治疗方法。现有治疗策略主要是基于 “淀粉样假说”，即认为淀粉样斑块的积累是导致阿尔茨海默病等神经退行性疾病的主要原因，因此试图通过破坏和清除成熟的淀粉样纤维和斑块来治疗疾病，一些相关药物也正处于研发和临床试验阶段。然而，越来越多的证据表明，纤维形成可能并非淀粉样变性疾病中组织和细胞损伤的唯一机制。例如，在一些研究中，降低胰岛素样生长因子 1（IGF1）信号诱导的 β 淀粉样肽过度聚集，反而改善了模型小鼠的阿尔茨海默病样症状；而且临床研究发现，淀粉样斑块负担与痴呆严重程度之间的相关性较弱，部分有大量斑块沉积的患者并未出现痴呆症状 。这意味着除了斑块积累外，还有其他致病因素，其中淀粉样蛋白的寡聚体形式在某些情况下可能比成熟纤维更具毒性，比如 β 淀粉样肽二聚体的毒性就大于大的聚集体。

CTSB 作为一种参与溶酶体蛋白降解的半胱氨酸蛋白酶，在巨噬细胞和多核组织细胞巨细胞（MGC）中表达，且在患者的淀粉样沉积物中也能检测到它的存在。因此，CTSB 被认为有可能成为治疗淀粉样变性疾病的潜在药物。不过，目前关于 CTSB 对成熟淀粉样蛋白影响的研究结果存在很大争议。一些研究表明，CTSB 能够降解由 α - 突触核蛋白和免疫球蛋白轻链形成的淀粉样蛋白，还能减少体外 β 淀粉样肽纤维结构的数量，在老年 hAPP 小鼠中过表达 CTSB 有助于减少淀粉样沉积物的形成；但也有研究指出，CTSB 对淀粉样蛋白的不完全降解会导致成核活性增加，诱导新的聚集体形成，反而可能加重疾病，敲除或敲低 CTSB 基因在某些神经疾病模型中能改善大脑功能 。所以，明确 CTSB 对成熟淀粉样纤维的作用机制和影响因素至关重要。

研究方法

1. 淀粉样纤维的制备与处理：分别用不同的方法制备了重组人 β - 2 微球蛋白（beta - 2 - microglobulin）、人 β 淀粉样肽（1 - 42）、鸡卵清溶菌酶（lysozyme）和重组人 α - 突触核蛋白的淀粉样纤维，并在形成成熟纤维后，用 CTSB 以 1/50 的比例处理，处理后通过在 57°C 孵育 10 分钟使 CTSB 失活 。

2. 多种检测技术：运用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）观察淀粉样纤维及其降解产物的形态；利用共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy）结合淀粉样特异性探针硫代黄素 T（thioflavin T，ThT）评估大纤维簇的大小变化；通过光谱测量，如使用分光光度计测量样品的吸收光谱、浊度和瑞利光散射（Rayleigh light scattering，RLS），用荧光分光光度计测定样品的内在荧光光谱、荧光各向异性和参数 A，以及使用圆二色谱（Circular dichroism，CD）光谱仪测量远紫外区的 CD 光谱，来分析淀粉样纤维结构和性质的变化；采用平衡微透析技术结合 ThT 检测淀粉样纤维降解过程中 β - 折叠结构的变化；运用 MTT 比色法评估淀粉样纤维及其降解产物对多种人类细胞系（人胚胎肾细胞系 Hek - 293、宫颈上皮样癌细胞系 HeLa TK -、胶质母细胞瘤细胞系 T98G 和真皮成纤维细胞系 DF1）活力的影响；通过非变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（pseudo - native SDS - PAGE）分析淀粉样纤维降解产物的大小 。

3. 数据分析：所有实验数据均来自 5 个独立的生物学重复，使用 GraphPad Prism 10.3.0 软件进行统计分析，数据以平均值 ± 标准差表示，通过 Shapiro - Wilk 检验判断数据是否符合正态分布，用 Levene 检验验证组间方差的齐性，采用非配对双尾 t 检验分析组间差异，p 值小于 0.01 被认为具有统计学意义 。

研究结果

1. CTSB 诱导模型淀粉样蛋白的降解：以溶菌酶淀粉样纤维为模型，研究发现 CTSB 作用下，淀粉样纤维会逐渐降解。TEM 观察到纤维长度显著缩短，24 小时后部分淀粉样片段失去纤维形态；SDS - PAGE 分析显示，完整的溶菌酶淀粉样蛋白样本几乎不含单体和低分子量的寡聚体，CTSB 处理后，样本中也未检测到溶菌酶单体或分子量小于 220kDa 的寡聚体水平增加，表明降解产物相对较大。延长孵育时间至 5 天，发现 24 小时和 5 天后纤维降解产物的形态、大小以及降解比例（约 40%）基本相同，因此确定后续实验中 CTSB 对其他淀粉样蛋白的处理时间为 24 小时 。

2. 分析不同蛋白形成的淀粉样蛋白降解产物的形态和稳定性：用 TEM 和共聚焦激光扫描显微镜观察发现，CTSB 处理后，所有研究的淀粉样蛋白（溶菌酶、β 淀粉样肽（1 - 42）、α - 突触核蛋白和 β - 2 微球蛋白形成的淀粉样蛋白）均被破坏，淀粉样蛋白簇的大小明显减小，纤维发生碎片化且有序形态被破坏。光谱测量结果显示，所有淀粉样纤维在 CTSB 作用后，浊度和 RLS 均下降，其中 α - 突触核蛋白淀粉样纤维的下降幅度最大（70 - 85%），溶菌酶淀粉样纤维的下降幅度最小（7 - 15%）。内在 UV 荧光光谱分析表明，β 淀粉样肽（1 - 42）、α - 突触核蛋白和 β - 2 微球蛋白形成的淀粉样蛋白在酶处理后，内在 UV 荧光强度增加，蛋白质环境变得松散；同时，含色氨酸蛋白形成的淀粉样蛋白的参数 A 发生变化，β - 2 微球蛋白淀粉样蛋白的参数 A 增加，溶菌酶淀粉样蛋白的参数 A 略有下降，β - 2 微球蛋白淀粉样蛋白的荧光各向异性降低。CD 光谱分析显示，大多数淀粉样蛋白（β 淀粉样肽（1 - 42）、α - 突触核蛋白和 β - 2 微球蛋白形成的淀粉样蛋白）在 CTSB 处理后，β - 折叠结构特征的 220nm 附近的最小值变得不那么明显，表明淀粉样片段结构的有序性降低，但溶菌酶淀粉样蛋白的 CD 光谱在酶处理后没有明显变化 。

3. 研究纤维及其降解产物与淀粉样特异性探针硫代黄素 T 的相互作用：利用平衡微透析技术结合 ThT 检测发现，CTSB 处理后，所有研究的淀粉样蛋白与 ThT 结合的吸收值均下降，表明淀粉样蛋白降解产物中有序 β - 折叠链的含量减少。其中，α - 突触核蛋白淀粉样蛋白的 ThT 吸收值下降最显著（超过 70%），溶菌酶和 β 淀粉样肽（1 - 42）淀粉样蛋白的下降幅度最小（30 - 40%），这进一步证实了不同淀粉样蛋白的降解效率存在差异 。

4. 分析淀粉样蛋白及其降解产物对永生化和原代细胞系活力的影响：MTT 实验结果显示，β 淀粉样肽（1 - 42）、α - 突触核蛋白、溶菌酶和 β - 2 微球蛋白形成的淀粉样蛋白均会降低所有研究细胞系的代谢活性，不同细胞系对淀粉样蛋白诱导的应激敏感性不同，如胶质母细胞瘤细胞系 T98G 对所有淀粉样蛋白及其降解产物的敏感性最低，人胚胎肾细胞系 Hek - 293 的敏感性最高，原代真皮成纤维细胞系 DF1 的敏感性与 Hek - 293 相当。值得注意的是，α - 突触核蛋白淀粉样纤维经 CTSB 降解后，对所有研究细胞系的细胞毒性显著降低，例如 HeLa TK - 细胞在接触 α - 突触核蛋白淀粉样蛋白降解产物后，细胞活力几乎完全恢复到完整细胞的水平 。

研究结论与讨论

1. CTSB 对淀粉样纤维作用的机制和效率：研究表明，CTSB 对淀粉样纤维的作用机制是双重的。一方面，CTSB 诱导淀粉样纤维碎片化，这意味着它能破坏淀粉样纤维 β - 折叠链之间的氢键；另一方面，CTSB 使纤维簇和片段的有序结构丧失，导致分子内接触（疏水、离子和 / 或共价键）不稳定。但所有研究的纤维都不会完全解离成单体亚基，CTSB 诱导的淀粉样蛋白降解是不可逆的。不同淀粉样纤维对 CTSB 的降解敏感性不同，α - 突触核蛋白形成的淀粉样纤维降解效率最高，这可能是因为其主要由细的单纤维组成，很少形成紧密的簇，使得 CTSB 结合位点更容易接近；而溶菌酶和 β 淀粉样肽（1 - 42）形成的淀粉样纤维直径较大且形成大量致密簇，对 CTSB 的作用更具抗性，CTSB 只能在其外周或最少屏蔽的区域进行部分降解 。

2. CTSB 降低淀粉样纤维细胞毒性的能力：与其他一些蛋白水解酶（如胰蛋白酶和 α - B - 晶状体蛋白）作用后会增加淀粉样蛋白对细胞的毒性不同，CTSB 降解淀粉样纤维不会形成具有更高细胞毒性的低分子量产物。对于与帕金森病相关的 α - 突触核蛋白淀粉样蛋白，CTSB 不仅能有效降低其聚集体的大小，还能减轻细胞应激，显著降低其对细胞的毒性。这可能是由于 α - 突触核蛋白淀粉样纤维结构较细且不易形成致密簇，使得 CTSB 能更有效地作用于其蛋白位点，实现有效降解并破坏其有序纤维结构 。

3. 使用 CTSB 作为抗淀粉样蛋白药物的 “陷阱” 和优势：虽然 CTSB 在降解淀粉样纤维方面有一定效果，且能降低部分淀粉样纤维的细胞毒性，但它也存在潜在的 “副作用”。CTSB 作用下淀粉样蛋白的降解产物中含有与完整淀粉样蛋白结构相同的纤维片段和寡聚体，这些片段和寡聚体可能作为 “种子” 加速新淀粉样纤维的形成，并在细胞间快速传播，就像酵母中朊病毒和朊病毒样聚集体的传播机制一样。不过，如果淀粉样蛋白是高度聚集且对 CTSB 降解有抗性的（如溶菌酶淀粉样蛋白），CTSB 处理可能主要导致其碎片化，虽不会大幅影响细胞毒性，但会加速淀粉样蛋白的形成和传播；而对于像 α - 突触核蛋白这样的细单纤维淀粉样蛋白或经过预解聚处理的淀粉样蛋白，CTSB 的作用会更有效，不仅能减小聚集体大小，还能破坏纤维结构，使降解产物不具备作为 “种子” 的能力且细胞毒性降低。因此，CTSB 与其他能增强蛋白水解位点可及性、降低淀粉样蛋白簇稳定性的因子联合使用，有可能成为安全有效的抗淀粉样蛋白药物的组成部分 。

这项研究首次全面展示了 CTSB 对不同聚集倾向的淀粉样纤维的降解作用，揭示了其既能破坏淀粉样结构又能使其碎片化的双重能力，并且明确了这种作用对淀粉样蛋白细胞毒性的影响取决于具体的作用过程。这不仅极大地推动了人们对 CTSB 在多种神经病理中调节淀粉样蛋白积累的分子机制的理解，也为开发新型抗淀粉样蛋白治疗策略提供了重要的理论依据和潜在的药物靶点，有望为淀粉样变性疾病的治疗带来新的突破。