靶向 CDK8/19：克服慢性髓性白血病耐药、加速癌细胞死亡的前沿策略

为解决慢性髓性白血病（CML）对 BCR-ABLi 耐药难题，俄罗斯科学院基因生物学研究所研究人员开展 CDK8/19 抑制对 CML 细胞影响的研究。发现 CDK8/19i 可增敏 BCR-ABLi，加速癌细胞死亡。极具科研价值，推荐一读！

　　

俄罗斯科学院基因生物学研究所（Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences）的研究人员 Alvina I. Khamidullina 等人在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “CDK8/19 inhibition attenuates G1 arrest induced by BCR-ABL antagonists and accelerates death of chronic myelogenous leukemia cells” 的论文。这篇论文在慢性髓性白血病（Chronic Myelogenous Leukemia，CML）治疗领域具有重要意义，为攻克 CML 治疗难题提供了新的思路和潜在治疗策略。

研究背景

慢性髓性白血病是一种血液系统恶性肿瘤，其主要遗传标志是由 t（9;22）（q34;q11）易位产生的费城染色体，该易位会生成致癌的 BCR-ABL 融合蛋白 。这种融合蛋白作为一种异常的酪氨酸激酶，激活众多下游信号通路，从而驱动 CML 以及其他一些肿瘤的发生发展。

甲磺酸伊马替尼（Imatinib mesylate，IM）等 BCR-ABL 酪氨酸激酶抑制剂（BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors，BCR-ABLi）的问世，极大地改善了 CML 患者的治疗效果。然而，部分患者在治疗过程中会逐渐对 BCR-ABLi 产生耐药性。耐药的原因一方面是 BCR-ABL 基因发生突变，改变了药物与靶点的相互作用；另一方面则与 BCR-ABL 非依赖的信号通路激活有关，比如 STAT3、MAPK/ERK、β -catenin 等信号通路的异常激活，以及自噬的增强 。此外，处于静止状态的白血病干细胞（Leukemia Stem Cells，LSC）对 BCR-ABLi 特别耐药，它们能够长期存活并导致疾病复发。细胞周期的停滞和静止状态受到多种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（Cyclin Dependent Kinase Inhibitor，CKI）的调控，而这些 CKI 的转录和表观遗传调控与 CML 对 BCR-ABLi 的耐药性密切相关 。

细胞周期蛋白依赖性激酶 8（Cyclin Dependent Kinase 8，CDK8）及其同源物 CDK19，与细胞周期蛋白 C、MED12 和 MED13 共同组成一个激酶模块，该模块与多蛋白中介体复合物相关，在基因表达调控中发挥着关键作用。CDK8/19 可以调节多种与癌症相关的转录因子，影响细胞对外部刺激的反应 。已有研究表明，CDK8/19 在肿瘤细胞对化疗药物的耐药性方面扮演着重要角色，选择性的 CDK8/19 小分子抑制剂（CDK8/19i）能够使肿瘤细胞对化疗药物更加敏感，因此被视为有潜力的抗肿瘤药物。

基于以上背景，研究人员推测抑制 CDK8/19 可能会影响 CML 细胞对 BCR-ABLi 的敏感性，进而为克服 CML 的耐药性提供新的方法，这便是开展这项研究的初衷。

研究方法

1. 试剂与细胞培养：研究中使用的试剂大多购自 Sigma-Aldrich 公司，IM 购自诺华公司，达沙替尼（Dasatinib）和尼罗替尼（Nilotinib）购自 Selleck Chemicals 公司，PF-114（vamotinib）由 Dr. G. Chilov 馈赠，CDK8/19i Senexin B（SenB）和 SNX631 购自 Senex Biotechnology 公司。人 CML 细胞系 K562 和 KU812 在含有 10% 胎牛血清、2 mM L - 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37℃、5% CO?的湿润环境中培养。

2. 实验处理：将处于对数生长期的细胞接种到 60 mm 培养皿中，分别用 CDK8/19i 或 BCR-ABLi 单独处理，或者将两者联合处理（CDK8/19i 在 BCR-ABLi 加入前 1 小时添加），对照组加入 0.02% DMSO。

3. 检测方法
   

• 流式细胞术：用于分析细胞周期分布、细胞凋亡情况、线粒体膜电位以及细胞增殖情况。通过不同的染色方法，如碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色检测细胞周期和死细胞，用 Annexin V 染色检测早期凋亡细胞，用 MitoTracker? Red CMXRos 检测线粒体膜电位，用 EdU 标记检测细胞增殖。

• RNA 测序（RNA Sequencing，RNASeq）：对 K562 细胞进行不同处理 8 小时后，提取总 RNA，制备 cDNA 文库并进行测序。通过对测序数据的分析，研究不同处理组基因表达的变化情况。

• 慢病毒转导：构建携带 CDKN1B/p27 开放阅读框的慢病毒质粒，转导 K562 细胞，获得可诱导表达 p27 的 K562p27tet-on 亚系，用于研究 p27 在细胞周期和药物敏感性中的作用。

• 免疫印迹法：检测细胞中相关蛋白的表达水平，通过蛋白质裂解、电泳分离、转膜、抗体孵育等步骤，对目标蛋白进行定性和半定量分析。

4. 数据分析：实验数据至少来自三个独立实验。采用单因素或双因素方差分析（Analysis of Variance，ANOVA），并结合 Sidak 事后检验进行多重比较，P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义。

研究结果

1. SenB 增强 IM 诱导的 K562 细胞凋亡：研究人员发现，SenB 能够使 K562 细胞对 IM 更加敏感。在 72 小时的处理后，IM 和 SenB 联合处理组的活细胞比例明显低于 IM 单独处理组，PI 阳性（晚期凋亡）细胞比例从 IM 单独处理时的 15.0 ± 0.3% 大幅增加到联合处理时的 54.0 ± 0.6% 。时间进程实验表明，在 24 小时时，1 μM SenB 就能显著增加低浓度 IM 处理后细胞的 subG1 事件（代表 DNA 碎片化的细胞）比例 。SenB 单独处理不会增加 Annexin V 阳性细胞比例，但与 IM 联合处理时，能协同提高这一比例。而对于 BCR-ABL 阳性的 KU812 CML 细胞系，因其本身对 IM 高度敏感，SenB 对 IM 诱导的高凋亡率没有显著影响。此外，联合抑制 CDK8/19 和 BCR-ABL 还能增加 K562 细胞中聚（ADP - 核糖）聚合酶 1（Poly (ADP - ribose) Polymerase 1，PARP1）的蛋白水解切割，且联合处理比 IM 单独处理更易诱导 PARP1 切割。SenB 还能显著增强 IM 诱导的线粒体膜电位下降，进一步表明 SenB 加速了 IM 诱导的 K562 细胞凋亡的起始和速率。不仅如此，SenB 还能增强其他不同化学类别的 BCR-ABLi（如尼罗替尼、达沙替尼、PF-114/vamotinib）诱导的细胞死亡，且与化学结构不同的 CDK8/19i SNX631 也能产生类似的敏化效果，说明这种敏化作用是 CDK8/19 抑制的普遍效应。同时，SenB 和 IM 联合处理能够降低 K562 细胞中总 STAT1 和 pSTAT1 S727 以及 STAT3 S727 的磷酸化水平。

2. IM 和 SenB 影响细胞周期相关基因的表达：RNASeq 分析显示，IM 处理会导致 2100 个基因下调，1756 个基因上调；SenB 处理则使 679 个基因下调，1017 个基因上调；两者联合处理导致 2394 个基因下调，2073 个基因上调 。与 IM 单独处理相比，添加 SenB 后，有 1185 个 mRNA 下调，1492 个 mRNA 上调。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）和过度表达分析（Over - Representation Analysis，ORA）表明，IM 下调的许多基因与细胞增殖和干扰素 / STAT 信号通路相关，而添加 SenB 后，虽然对 IM 影响的主要信号通路没有产生重大改变，但 IM + SenB 与 IM 单独处理相比，差异表达基因中有 17.1% 与细胞周期负调控相关，且 IM 上调的与细胞周期负调控相关的基因（如 VASH1、PCBP4、GPNMB、INHA 和 BTN2A2）在 IM + SenB 处理的细胞中均下调，说明 SenB 主要作用是减弱 IM 诱导的细胞周期负调控。

3. CDK8/19 抑制解除 IM 诱导的 G1 期阻滞并增加复制应激标记：RNASeq 分析结果显示，细胞增殖驱动因子 c-Myc 在 IM 处理下表达下调，在 SenB 处理下表达上调，IM + SenB 处理时其表达水平与未处理的对照组相同；而细胞周期抑制剂 CDKN1B（p27Kip1）在 IM 处理下强烈上调，在 SenB 处理下下调，IM + SenB 处理时其表达无明显变化。蛋白质免疫印迹实验也证实了这一结果，IM 处理会使 K562 细胞中 p27Kip1 蛋白水平呈剂量依赖性增加，而 SenB 能显著抑制这一效应。此外，IM 还会上调 p57Kip2 和 p18INK4c，SenB 对 p57Kip2 和 p18INK4c 的影响较小，对 c-Myc 蛋白的影响也较轻微。为了探究 p27Kip1 是否介导了 SenB 对 K562 细胞对 IM 的敏化作用，研究人员构建了可诱导表达 p27 的 K562p27tet-on 细胞系。结果发现，诱导 p27 表达会增加细胞的 G1 期比例，减弱 IM 诱导的细胞凋亡，而 SenB 能剂量依赖性地减轻 p27 诱导的 G1 期阻滞，增加 subG1 事件和循环细胞（S 期和 G2/M 期）的比例，克服 p27 诱导的保护作用。进一步研究发现，K562 细胞在 IM + SenB 处理后，G1 期阻滞是短暂的，部分细胞会重新进入细胞周期，而 IM 单独处理时 G1 期阻滞会持续存在。通过 EdU 标记实验发现，IM + SenB 处理的细胞在 14 - 20 小时重新进入 S 期的比例增加，但随后会在 S 期发生阻滞，同时凋亡率上升。而且，IM + SenB 处理的细胞中，复制应激标记物磷酸化 RPA32（pRPA32）和 Chk1 的 S345 磷酸化水平升高，同时 DNA 修复蛋白 BRCA1 和 Rad51 在 24 小时时表达下调，表明联合处理抑制了 DNA 修复。

研究结论与讨论

在 CML 的治疗中，IM 虽然疗效显著，但由于耐药性问题，患者需要持续治疗以防止复发，其中非突变耐药尤其是静止期驱动的耐药是当前面临的重大挑战。本研究表明，CDK8/19i（如 SenB 和 SNX631）能够使 K562 CML 细胞对多种 BCR-ABLi 更加敏感，显著增加细胞凋亡率。其作用机制主要包括以下几个方面：一是调节基因表达，CDK8/19i 改变了 IM 对基因表达的影响，减弱了 IM 诱导的细胞周期负调控；二是影响细胞周期，CDK8/19i 解除了 IM 诱导的 G1 期阻滞，使细胞重新进入细胞周期，导致复制应激增加，最终引发细胞死亡；三是抑制相关信号通路，联合处理降低了 STAT1 和 STAT3 的磷酸化水平，抑制了这些促存活信号通路，增强了 BCR-ABLi 的疗效。

与以往研究不同的是，本研究发现 CDK8/19i 对 CML 细胞的作用具有细胞类型特异性。在 BCR-ABL 阳性的 KU812 细胞中，SenB 对细胞周期和相关蛋白表达没有明显影响，这些细胞对 IM 高度敏感，以 CDK8/19i 非依赖的方式迅速死亡。这一发现提示在临床治疗中，针对不同类型的 CML 细胞，可能需要采用不同的治疗策略。

综上所述，本研究揭示了 CDK8/19i 与 BCR-ABLi 联合治疗 CML 的潜在机制，为克服 CML 的耐药性提供了新的理论依据和治疗策略。未来，有望通过进一步优化联合治疗方案，提高 CML 患者的治疗效果，改善患者的预后，为 CML 的临床治疗带来新的突破。