匈牙利猪群中猪瘟病毒（APPeV）流行率评估及样本类型影响深度剖析

为解决 APPeV 在商业猪场流行率不明及诊断难题，匈牙利兽医大学的研究人员开展匈牙利猪群 APPeV 流行率及样本类型影响的研究。结果显示其在匈牙利猪群广泛分布。该研究对猪群疫病防控意义重大，推荐科研读者阅读。

　　

匈牙利兽医大学（University of Veterinary Medicine）的 Lilla Dénes 等人在《Porcine Health Management》期刊上发表了题为 “Prevalence estimation of Pestivirus scrofae (atypical porcine pestivirus) among Hungarian pig herds and the effects of different sample types on detection rates” 的论文。这篇论文对于猪健康管理领域意义重大，它深入探究了匈牙利猪群中猪瘟病毒（Pestivirus scrofae，又称非典型猪瘟病毒，APPeV）的流行情况，以及不同样本类型对病毒检测率的影响，为猪群疫病防控和健康管理提供了关键依据。

研究背景

APPeV 属于黄病毒科（Flaviviridae family）瘟病毒属（Pestivirus genus），2015 年在美国通过对感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）动物样本的下一代测序分析被发现。此后，在欧洲、加拿大、亚洲、巴西等地均有发现，甚至在德国、塞尔维亚、西班牙、意大利、韩国的野猪样本中也检测到了该病毒。

实验表明，感染 APPeV 的怀孕母猪所产仔猪会出现先天性震颤（CT）A-II 型临床症状，常伴有八字腿。在 CT 疫情爆发时，仔猪死亡率较高，例如在巴西南部的研究中，受 CT 影响且 APPeV 检测呈阳性的仔猪断奶前死亡率达 30%。此外，APPeV 还会降低繁殖性能，在商业猪场疫情爆发期间，繁殖性能可下降 10% 。

APPeV 在猪的多种组织中均有较高的基因组载量，如全血、气管支气管和肠系膜淋巴结、脾脏、鼻腔拭子等，还可在精液中检测到，这表明感染的雄性可能通过精液传播病毒。

不同国家分离出的 APPeV 毒株存在较高的遗传多样性。此前，不同国家对 APPeV 的流行率评估结果差异较大，这与采样方法不同有关。目前，APPeV 的诊断主要依赖分子检测，但由于商业 ELISA 试剂盒尚未上市，且现有分子检测方法存在特异性和敏感性问题，因此，系统研究 APPeV 在商业大规模猪场的流行率很有必要。匈牙利兽医大学的研究团队正是基于这样的背景，开展了此项研究。

研究方法

1. 样本采集：研究人员在 2021 年至 2022 年期间，从 26 个匈牙利农场和 1 个斯洛伐克农场系统地采集了 2650 份血清、198 份口腔液和 163 份加工液样本。这些样本来自不同年龄组的猪，包括 2 - 18 周龄的猪、后备母猪以及不同胎次的母猪。血清样本用于多种病毒筛查；加工液样本是 3 - 5 天龄雄性仔猪阉割后的浆液，从多个不同窝中采集；口腔液样本则分别从 10 周龄处于电池 / 后续饲养阶段和 20 周龄育肥阶段的猪中获取。
2. 病毒 RNA 提取与 PCR：使用 Indispin/Cador Pathogen Mini Kit 和 QIAcube 自动核酸提取机器人，按照制造商的说明从血清、加工液和口腔液样本中提取病毒 RNA。提取的核酸用洗脱缓冲液（EB）洗脱后，立即进行逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）分析或储存于 - 80°C 备用。
3. RT - qPCR：采用多重 TaqMan 分析方法，针对 NS3 和 NS5b 区域设计荧光标记探针，对样本进行 RT - qPCR 分析。反应体系和温度条件严格按照实验方案进行，通过特定的荧光检测通道收集数据。对于 APPeV 检测呈阳性（Cq 值≤30）的样本，使用针对 NS2 - 3 区域的测序引物进行 RT - PCR。
4. 测序和系统发育分析：对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下合适长度的扩增子，用 Qiagen Gel Extraction Kit 纯化。通过商业机构进行双向 Sanger 测序，使用 Chromas 2.6.6 软件可视化原始电泳图，与 GenBank 中的参考菌株比对并校正错误。利用 BLASTn 在线软件识别序列，通过 MAFFT 7 在线软件进行序列比对，使用 MEGA X 软件进行最大似然（ML）分析和系统发育树构建。
5. 统计分析：将 RT - qPCR 分析结果记录成表格形式，使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析。先检查数据集是否符合正态分布，若符合则进行单因素方差分析（one - way ANOVA）并进行 Tukey 事后检验；若不符合则进行非参数 Kruskal - Wallis 检验和 Dunn 事后检验。使用 EpiTools 计算农场层面的估计真实流行率，并计算 95% 置信区间的 Blaker 置信限。

研究结果

1. 流行率研究：对来自匈牙利和斯洛伐克农场的样本检测发现，26 个匈牙利农场中有 18 个被检测出 APPeV 感染，计算得出的流行率为 66.67%，农场层面病毒的估计真实流行率为 13.9%（95% CI：10.9%，17.5%），斯洛伐克农场的样本中也检测到了该病毒。在 APPeV 阳性的匈牙利农场中，血清样本的病毒检出率平均为 21%，加工液样本为 57%，口腔液样本为 72%。不同农场的病毒检测率差异较大，部分农场仅在特定样本类型中检测到病毒，有五个农场在三种样本类型中均检测到病毒。
2. 不同年龄组感染动态分析：对 APPeV 阳性农场不同年龄组的感染动态分析显示，10 周龄动物的血清样本阳性率约为 27%，14 周龄和 18 周龄动物约为 17%，6 周龄和 8 周龄动物约为 15%，12 周龄猪血清池的阳性率约为 4%，母猪样本中仅约 6% 检测到病毒。通过对样本 Cq 值的分析发现，不同年龄组之间存在显著差异，其中 14 周龄动物血清样本和 10 周龄动物口腔液样本的 Cq 值差异显著（p<0.0072）。同时，血清样本与加工液样本、血清样本与口腔液样本的 Cq 值也存在显著差异（p<0.0287 和 p<0.0137），血清样本的 Cq 值更高。
3. 序列分析：对 15 个农场血清样本的 NS2 - 3 蛋白编码区部分序列进行测定，并与之前研究的序列以及 GenBank 中的相关序列进行比较。系统发育分析表明，APPeV 在不同国家间存在高度变异性，中国菌株之间的遗传距离最大（24.3%）。匈牙利菌株未根据单个农场形成单独的群体，来自不同地理位置农场的菌株序列可能高度相似，甚至完全相同。

研究结论与讨论

1. 研究结论：该研究估计了匈牙利大规模工业猪群中 APPeV 的感染流行率，发现其在匈牙利猪群中广泛分布。研究还揭示了不同样本类型在病毒检测中的重要性，加工液和口腔液样本在非侵入性诊断方面具有重要价值，可用于高效的群体水平病毒检测。此外，研究分析了 APPeV 菌株的起源和系统发育关系，发现菌株缺乏地理特异性，可能与感染的无症状动物贸易有关。
2. 讨论：与西班牙的研究相比，匈牙利猪群中 APPeV 的流行率较高。这可能与采样方法、样本数量以及农场实际情况等多种因素有关。在本研究中，部分农场未能检测到病毒，可能是样本数量不足或存在其他未知因素。研究还发现，为有效诊断 APPeV 感染，每个农场应采集 5 份以上的加工液样本。虽然加工液样本可用于检测新生动物的感染情况，但在采样时部分阳性农场未观察到先天性震颤症状，这可能是动物在子宫内感染的时期不同导致。
3. 研究意义：这项研究对于猪群健康管理和疫病防控意义非凡。明确 APPeV 在匈牙利猪群中的流行情况，有助于猪场管理者及时采取防控措施，减少病毒传播带来的损失。了解不同样本类型对检测率的影响，能够帮助兽医和研究人员选择更合适的样本进行检测，提高诊断的准确性和效率。此外，对 APPeV 菌株系统发育关系的分析，为追踪病毒传播途径、制定针对性的防控策略提供了有力依据。未来研究可进一步关注野猪在 APPeV 传播中的作用，以及病毒遗传变异对其致病性和传播能力的影响，为猪群健康保驾护航。