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为解决膀胱癌治疗中 BCG 疗效不佳的问题，石河子大学医学院的研究人员开展了 Mcl-1 下调联合 BCG 治疗膀胱癌的研究。结果显示该联合治疗可促进巨噬细胞极化，提升疗效。这为膀胱癌治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。
石河子大学医学院（Department of Pathophysiology, Shihezi University School of Medicine）的研究人员 Caixia Tan、Chen Li 等人在《Cancer Cell International》期刊上发表了题为 “Mcl-1 downregulation enhances BCG treatment efficacy in bladder cancer by promoting macrophage polarization” 的论文。该研究在膀胱癌治疗领域具有重要意义，为提升卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）治疗膀胱癌的效果提供了新的思路和理论依据，有望推动肿瘤免疫治疗的发展。
研究背景
膀胱癌（Bladder cancer）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，全球发病率和死亡率呈上升趋势。它主要分为非肌层浸润性膀胱癌（Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（Muscle-invasive bladder cancer，MIBC）。NMIBC 预后相对较好，可通过经尿道膀胱肿瘤电切术（Transurethral resection of bladder tumor，TURBT）和 BCG 免疫疗法进行治疗；而 MIBC 的治疗则更为复杂。
BCG 是一种减毒活疫苗，最初用于预防结核病。自 1976 年以来，它被用于治疗 NMIBC，通过激活膀胱的免疫微环境来抑制肿瘤生长。然而，BCG 治疗面临着耐药性、膀胱刺激和安全风险等挑战。巨噬细胞（Macrophages）是肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）中常见的免疫细胞，可极化为促炎的 M1 型和抗炎的 M2 型。M1 型巨噬细胞具有抗肿瘤作用，M2 型则促进肿瘤生长。此前研究表明，BCG 治疗膀胱癌可能促进巨噬细胞向 M1 型极化。
髓细胞白血病基因 - 1（Myeloid cell leukemia gene-1，Mcl - 1）是 Bcl - 2 家族的关键成员，抑制细胞凋亡，参与多种癌症的发生发展。研究团队前期发现，敲低 Mcl - 1 可改变 BCG 刺激下巨噬细胞的极化，这表明 Mcl - 1 下调可能调节巨噬细胞极化，进而影响 BCG 对膀胱癌细胞的作用。此外，c-Jun N 端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路在细胞应激反应、凋亡和肿瘤发生中起关键作用，其失调会影响细胞环境，是潜在的治疗靶点。在膀胱癌中，JNK 通路与细胞凋亡密切相关。同时，连接蛋白 43（Connexin 43，CX43）作为细胞间隙连接的主要蛋白，参与细胞间通讯和组织稳态调节，其表达与肿瘤发展相关。已有研究显示，JNK 信号通路、抗凋亡的 Mcl - 1 基因和 Cx43 基因之间存在相互作用，共同调节膀胱癌细胞的增殖和凋亡。因此，研究人员推测下调 Mcl - 1 可能通过影响巨噬细胞极化来影响 BCG 治疗膀胱癌的效果，且这一过程与 JNK 信号通路激活和 CX43 表达密切相关。
研究方法
- 数据处理与分析：利用 GEOquery 软件包从 NCBI-GEO 数据库下载 GSE190529 数据集，该数据集包含接受 BCG 灌注的膀胱癌患者的基因表达数据。运用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）进行质量控制，然后通过 DESeq2 软件包进行差异基因表达分析，筛选出差异表达基因。使用 clusterProfiler 软件包对差异基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析以及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。通过加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）探究基因相互作用和网络，找出与 Mcl - 1 相关的基因模块，对模块内基因与差异表达基因的交集进行富集分析。
- 实验分组与模型建立：在体外实验中，将细胞分为（BCG + M0）-MB49 共培养组、（BCG + Mcl - 1shRNA + M0）-MB49 共培养组和（BCG + Mcl - 1shRNA + M0 + SP600125）-MB49 共培养组。利用 Raw264.7 巨噬细胞和 MB49 膀胱癌细胞共培养建立肿瘤微环境模型，其中 Raw264.7 细胞感染 BCG 后，转染 Mcl1shRNA 质粒，部分再加入 JNK 信号通路抑制剂 SP600125。在体内实验中，选取健康雌性 Sprague-Dawley 大鼠，随机分为对照组和膀胱癌组。通过经尿道膀胱灌注 N - 甲基 - N - 亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）建立膀胱癌模型。建模成功后，将膀胱癌大鼠随机分为模型组（BLCA）、BCG 组、BCG 联合 Mcl - 1shRNA 干预组（BCG + Mcl - 1shRNA）和 BCG、Mcl - 1shRNA 及 SP600125 联合治疗组（BCG + Mcl - 1shRNA + SP600125）。
- 检测方法：采用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测细胞培养上清中 M1 巨噬细胞相关因子肿瘤坏死因子 -α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和 M2 巨噬细胞相关因子白细胞介素 - 10（Interleukin-10，IL-10）的表达水平。运用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测相关蛋白的表达。通过免疫荧光分析（Immunofluorescence analysis）观察细胞中蛋白的表达和定位。使用细胞计数试剂盒 8（Cell Counting Kit-8，CCK8）评估细胞增殖能力。采用 Transwell 实验检测细胞的迁移和侵袭能力。利用 Hoechst 33258 染色和流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞凋亡情况。对膀胱组织进行苏木精 - 伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining，HE staining）、TUNEL 染色、免疫组化（Immunohistochemistry）等，评估组织病理变化、细胞凋亡和蛋白表达情况 。
研究结果
- 生物信息学结果
- 差异基因分析：对 GSE190529 数据集进行分析，经 PCA 和 UMAP 降维可视化后，筛选出 157 个差异基因，其中 61 个上调，96 个下调。GO 富集分析显示，这些差异基因主要与免疫球蛋白结合、异型细胞间粘附等分子功能相关；KEGG 富集分析表明，其涉及造血细胞系相关通路，如氨酰 - tRNA 生物合成、B 细胞受体信号通路等；GSEA 富集分析发现，激活的通路包括氨酰 - tRNA 生物合成、氧化磷酸化等，而 Wnt 信号通路主要被抑制。
- Mcl - 1 相关基因分析：通过 WGCNA 分析，确定了与 Mcl - 1 特征相关性最强的 Darkslateblue 基因模块，包含 6936 个基因。进一步筛选出 38 个与 Mcl - 1 特征高度相关且差异表达的基因，GO 富集分析显示这些基因参与热生成、体温调节、应激激活的 MAPK 级联反应等生物学过程；KEGG 富集分析强调了 MAPK 信号通路在其中的重要作用，提示 Mcl - 1 基因与 MAPK 信号通路在 BCG 治疗膀胱癌过程中关系密切。
- 体外实验结果
- 巨噬细胞极化：ELISA 检测显示，（BCG + Mcl - 1shRNA + M0）-MB49 共培养组中 M1 型巨噬细胞相关因子 TNF-α 表达显著增加，M2 型相关因子 IL-10 表达显著降低；Western blot 结果表明，下调 Mcl - 1 后，M1 巨噬细胞相关因子（CD86、iNOS）表达增加，抑制 JNK 信号通路后，这些因子表达下降，而 M2 巨噬细胞极化相关因子（CD206、Arg-1）表达变化不明显。这表明 Mcl - 1 shRNA 联合 BCG 可促进肿瘤相关巨噬细胞向 M1 型极化。
- 对 MB49 细胞的影响：细胞划痕实验、Transwell 侵袭实验和 CCK8 实验结果显示，（BCG + Mcl - 1shRNA + M0）-MB49 共培养组中 MB49 细胞的迁移、侵袭和增殖能力均显著低于（BCG + M0）-MB49 共培养组，而添加 SP600125 后，这些能力有所回升。这说明 Mcl - 1shRNA 联合 BCG 可抑制 MB49 细胞的增殖、迁移和侵袭。
- 细胞凋亡：Hoechst 33258 凋亡染色和流式细胞术检测结果表明，（BCG + Mcl - 1shRNA + M0）-MB49 共培养组中 MB49 细胞凋亡率显著高于（BCG + M0）-MB49 共培养组，添加 SP600125 后，凋亡率降低。同时，Western blot 分析显示，联合干预可使 ASK1/MKK7/JNK 信号通路相关蛋白（P-ASK1、P-MKK7、P-JNK、P-cJUN）和 CX43 蛋白表达增加，添加 SP600125 后表达下降。这表明 Mcl - 1shRNA 联合 BCG 可通过激活 ASK1/MKK7/JNK 信号通路促进 MB49 细胞凋亡 。
- 动物实验结果
- 模型鉴定与剂量筛选：通过腹部超声检查确认膀胱癌模型建立成功。对不同剂量 Mcl - 1shRNA 质粒处理的大鼠进行检测，发现 85 μg 剂量处理 7 天可有效抑制膀胱癌细胞中 Mcl - 1 蛋白表达，且效果与 100 μg 剂量相近，因此选择 85 μg 作为后续实验的最佳剂量。
- 对膀胱癌组织的影响：免疫荧光染色显示，（BCG + Mcl - 1shRNA）组膀胱组织中 CD86/CD206 表达增加，而（BCG + Mcl - 1shRNA + SP600125）组表达下降；HE 染色结果表明，BCG 和（BCG + Mcl - 1shRNA）组对膀胱癌均有治疗效果，且联合治疗效果优于单独使用 BCG，添加 SP600125 后治疗效果减弱；Western blot 分析显示，（BCG + Mcl - 1shRNA）组中细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）和增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）表达降低，促凋亡蛋白 Bax 表达增加，抗凋亡蛋白 Bcl - 2 表达减少，添加 SP600125 后这些变化被逆转；免疫组化和 Western blot 检测结果显示，（BCG + Mcl - 1shRNA）组中 P-JNK、P-cJUN 和 CX43 表达增加，添加 SP600125 后表达下降。这些结果表明，Mcl - 1shRNA 联合 BCG 可促进膀胱癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，且这一过程与 ASK1/MKK7/JNK 信号通路和 CX43 表达相关。
研究结论与讨论
研究结果表明，下调 Mcl - 1 可通过激活 ASK1/MKK7/JNK 信号通路促进巨噬细胞向 M1 型极化，增强细胞间通讯，从而提高 BCG 治疗膀胱癌的疗效。这一发现为膀胱癌治疗提供了新的潜在策略，为肿瘤免疫治疗的进一步探索开辟了新方向。
膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤，NMIBC 术后复发率较高，部分会进展为 MIBC。BCG 免疫疗法虽广泛应用于 NMIBC 治疗，但部分患者存在治疗无效或复发的问题。本研究发现，Mcl - 1 可能成为膀胱癌治疗的关键靶点，Mcl - 1shRNA 联合 BCG 可有效抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡，通过调节巨噬细胞极化改变肿瘤微环境。在巨噬细胞极化方面，M1 型巨噬细胞对抑制膀胱癌发展起积极作用，M2 型则相反。BCG 治疗可使巨噬细胞向 M1 型极化，本研究进一步证实 Mcl - 1shRNA 联合 BCG 能增强这一极化过程，抑制肿瘤进展。
JNK 信号通路在细胞增殖、死亡和分化中起关键作用，在膀胱癌中，其与巨噬细胞极化的关系尚不明确。本研究通过生物信息学分析和实验验证，发现 Mcl - 1 联合 BCG 可通过激活 ASK1/MKK7/JNK 信号通路影响膀胱癌细胞巨噬细胞的极化，为揭示膀胱癌的病理机制和优化 BCG 治疗提供了新的分子机制。此外，研究还发现 CX43 在 Mcl - 1shRNA 联合 BCG 治疗膀胱癌过程中表达增加，推测其可能作为巨噬细胞间的通讯通道，在免疫反应中发挥重要作用。
未来研究可进一步深入探讨 Mcl - 1 与 JNK 通路之间复杂的调控机制，以及间隙连接在巨噬细胞中的具体功能。同时，将生物信息学分析与体内外实验相结合，有助于验证 JNK 信号通路在其他肿瘤治疗中的适用性，为临床应用提供更坚实的科学依据，有望开发出更有效的膀胱癌治疗方法，推动肿瘤免疫治疗领域的发展。
