综述：前沿洞察：中枢神经系统肿瘤患者来源模型在功能精准医学中的机遇、挑战与未来展望

为解决基于基因组学的精准医学局限性问题，北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员开展中枢神经系统肿瘤患者来源模型（PDMCTs）在功能精准医学（FPM）应用的研究。结果表明不同模型各有优劣，该研究为 FPM 发展提供参考，值得科研人员一读。

　　

在本文中，北卡罗来纳大学教堂山分校埃谢尔曼药学院药物工程与分子药剂学系（Eshelman School of Pharmacy, Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, University of North Carolina at Chapel Hill）的研究人员回顾了从基于基因组学的精准医学向功能精准医学的范式转变。功能精准医学通过在体外直接处理患者的活体肿瘤来评估治疗效果，以便更好地预测患者对治疗的个体反应。研究人员探讨了几类中枢神经系统肿瘤的患者来源模型（patient-derived models of central nervous system tumors，PDMCTs），并强调了每种模型的独特特征。每类模型都有望改善治疗方案的选择、延长患者生存期并提高患者的治疗效果。

过去二十年，中枢神经系统（central nervous system，CNS）肿瘤研究在癌症生物学、肿瘤起源细胞和分子特征方面取得了进展，从而对 CNS 肿瘤进行了更精确的重新分类。这些生物学发现推动了精准肿瘤学时代的发展，在这个时代，肿瘤特异性分子异常可以与针对该异常设计的靶向药物相匹配。然而，大多数 CNS 肿瘤患者并未从这种精准肿瘤学范式中获益。在 2006 年至 2020 年期间，新型靶向小分子抑制剂大量涌现，但患者对靶向治疗药物的适用率仅从 5% 小幅提高到 13%，且对这些药物的反应率仍然很低，仅从 3% 上升到 7%。在 NCI-MATCH 试验中，研究人员研究了 27 种不同的基因组靶向疗法对 765 名具有匹配癌症基因的受试者的作用，结果显示总体反应率仅为 10.3%（79/765）。这些结果凸显了基于基因组学的精准肿瘤学方法的主要局限性：第一，并非所有肿瘤都含有可作用的突变；第二，看似驱动肿瘤的可作用突变可能与其他冗余甚至相互矛盾的突变同时出现；第三，即使分子特征相同的肿瘤，对同一种药物的反应也可能存在很大差异。这些局限性促使研究向功能测试范式转变，即通过在体外直接处理个体的活体患者组织来评估治疗效果，从而衡量患者的个体反应。

利用患者来源模型进行的个性化功能测试在临床环境中指导治疗具有巨大潜力，并且已经开始作为许多癌症适应症的临床试验入组标准。Acanda De La Rocha 等人通过招募复发或难治性实体瘤和血液恶性肿瘤患者实施功能精准医学（functional precision medicine，FPM），他们利用短期的患者来源肿瘤培养物进行药物敏感性测试和基因分析，以提供治疗建议。接受 FPM 指导治疗的患者中，83% 的无进展生存期（progression free survival，PFS）改善超过了 1.3 倍。值得注意的是，接受 FPM 指导建议的患者与未接受此类指导的患者相比，PFS 和客观缓解率均显著提高。目前，有几项正在进行的前瞻性临床试验旨在取得类似结果，包括针对结直肠腹膜转移（NCT06057298）、肉瘤和黑色素瘤（NCT04986748）以及乳腺癌（NCT05177432）的患者定制治疗。EXALT 试验利用患者来源模型预测血液恶性肿瘤的反应，结果表明，使用 FPM 指导治疗可使无进展生存期延长 1.3 倍。共临床试验（Co-clinical trials）中，模型与人体试验同时进行相同的程序和分析，甚至在小鼠身上也进行过此类试验。这些研究都基于这样一种信念，即尽早选择正确的治疗方法有助于延长患者生存期并改善总体治疗效果，同时可能降低成本并减少对人体的影响。

在这篇综述中，北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员专注于使用中枢神经系统肿瘤患者来源模型（PDMCTs）的 FPM。与血液恶性肿瘤和能提供大量组织的肿瘤（如卵巢癌）相比，这一领域的研究相对较少。FPM 有效指导治疗的能力取决于每个模型的质量，研究人员确定了具有临床参考价值的模型所需的几个关键方面，包括每个模型中肿瘤的建立率、建立肿瘤和进行所需检测的时间、成本、基因保真度、每个模型捕捉肿瘤微环境多样性的能力，以及每个模型是否能够评估脱靶毒性。

研究人员使用这些标准分析了每种模型的优缺点，讨论了它们的优势和劣势，评估了它们的实用性，并提出了每种模型可为下一代精准肿瘤学提供参考的方面。

中枢神经系统肿瘤的患者来源模型

理想的支持 FPM 的 PDMCT 应与个体患者的肿瘤高度相似，并能准确预测患者对治疗的反应。开发这样的模型需要满足一系列独特要求，与药物开发的要求有所不同。没有任何模型能够完美重现原位肿瘤的所有方面，因此，在科学家不断改进现有模型并提出新想法的过程中，必须了解每种模型的优势和局限性。接下来，研究人员讨论了成功构建 PDMCT 的几个重要标准。

1. 建立率：患者肿瘤组织在 PDMCT 中的高建立率是有效构建 PDMCT 的基础。对于侵袭性癌症，如胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM），体外培养更容易，因此在某些 PDMCT 中的建立率较高。相反，低级别肿瘤在体外的可重复性维持则面临挑战。对于许多不同的 PDMCT，建立率与给定肿瘤的分级和侵袭性直接相关。因此，特定 PDMCT 的建立率可能因原发肿瘤的特征而有很大差异。在这篇综述中，研究人员列举了每种 PDMCT 中几种不同肿瘤亚型的建立率，以体现这种内在差异。由于功能模型的最终目标是在患者接受治疗前预测其反应，因此成功 “建立” 的功能模型至少应能在初始操作和药物测试的必要期间维持，并能对治疗产生可测量的反应。如果患者的肿瘤无法在体外建立，那么该患者将不适合接受 FPM。需要注意的是，研究人员在此不关注源自其他模型的模型建立率，如由患者来源细胞系或类器官产生的患者来源异种移植物，只关注直接从切除的、未经培养的患者 CNS 肿瘤组织生成的模型。

2. 时间：为了使 PDMCT 提供具有临床可操作性的结果，必须在临床意义的时间范围内完成。通常，脑肿瘤诊断手术与辅助治疗开始之间的时间仅为几周。因此，PDMCT 需要在这个狭窄的时间范围内给出结果，且越早越好。由于每个模型都是个性化的，这个时间范围包括建立用于功能测试的肿瘤所需的时间和完成功能检测所需的时间。

3. 成本：不久前，癌症的分子分析成本过高，无法为广泛的基于精准肿瘤学的治疗决策提供依据。随着这些检测成本的降低，分子分析已成为临床治疗流程中的标准诊断环节。能够为基于功能精准肿瘤学的治疗决策提供依据的 PDMCT 必须满足类似的成本标准，检测成本要低到足以实现广泛应用。

4. 基因保真度：为了最大程度地预测个性化治疗结果，PDMCT 必须通过维持原发肿瘤的基因特征和肿瘤内异质性来准确模拟原发肿瘤。一般来说，保真度是指模型重现最初切除肿瘤的能力；然而，由于 PDMCT 和体内残留肿瘤都可能发生与最初切除肿瘤的基因漂移，一些 PDMCT 可被设计用于预测残留肿瘤随时间的变化以及与残留肿瘤一起发生的漂移。这种纵向漂移预测难以实施和验证，因此在这篇综述中，研究人员考虑的是与原发肿瘤相比的基因保真度维持情况。因此，理想情况下，PDMCT 应尽可能将切除肿瘤的大部分维持在接近原始状态。许多模型优先维持特定的细胞群体，导致细胞选择存在偏差，无法完全重现整个肿瘤。此外，模型中捕获的肿瘤随时间的基因漂移也是 PDMCT 中一个值得关注的问题。许多模型已经通过严格的方案优化来尽量减少漂移。通常，模型需要及时测试，以准确重现肿瘤并防止基因改变。此外，细胞状态已被证明会驱动恶性胶质母细胞瘤细胞的异质性。了解潜在的遗传学和基因漂移对维持内在异质性的能力具有重要意义。

5. 肿瘤环境捕获：脑肿瘤的微环境不仅包括肿瘤细胞，还包括内皮细胞、神经元、神经胶质细胞和免疫细胞。仅巨噬细胞在人类脑肿瘤中的占比就可能在 4% 到 78% 之间，在胶质母细胞瘤中平均占 45%，在脑膜瘤中占 44%，在髓母细胞瘤中占 6%。这些细胞并非旁观者，因为肿瘤的行为与微环境中不同细胞群体之间的相互作用有关，并且也是不同治疗方法的靶点。此外，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）与治疗耐药性有关，这是评估患者治疗敏感性的重要部分。了解新模型是否以及能够捕获这些联系和相互作用至关重要。此外，一些 PDMCT 将肿瘤组织移植到具有生命的环境系统中，该系统可以在不同细胞群体之间形成新的联系和相互作用。微环境已被证明会影响胶质母细胞瘤中不同细胞状态的频率，进而影响肿瘤的异质性。为功能测试设计的 PDMCT 应捕获这些多样的肿瘤成分，并促进它们之间的相互作用。

6. 评估脱靶毒性：虽然杀死肿瘤的疗效是潜在治疗方法的关键方面，但评估选择性肿瘤杀伤和脱靶毒性也至关重要。由于不同药物的效力不同，其有害副作用也会有所差异。与肿瘤微环境分离的完整外部环境有助于在局部、器官特异性和 / 或全身水平评估靶向和脱靶毒性。PDMCT 评估这些不同方面毒性的能力可以平衡治疗效果与有害副作用。

目前，研究人员正在研究患者来源细胞系、异种移植物、类器官、外植体以及移植到器官型脑片培养物上的肿瘤满足这些标准的能力（图 1）。

患者来源细胞系

永生化细胞系是临床前新型治疗药物测试的主要手段。基于细胞培养检测的测试可以快速重复以证明其可重复性，这使得患者来源细胞系在药物开发中发挥着关键作用。研究已经明确，许多永生化细胞系在多年的重复传代过程中与原发肿瘤存在差异。事实上，许多永生化细胞系已无法准确代表其起源的肿瘤类型，更无法代表个体患者。为了解决这一局限性，研究人员致力于通过改进培养方法来提高细胞系的基因完整性。

患者来源细胞系是从手术切除过程中收集的患者组织碎片中分离出来的，并在多种不同的培养基中培养。然而，与从美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）等保藏机构购买的永生化细胞系不同，建立新的患者来源细胞系是一个繁琐的过程。虽然建立这些细胞系的具体方案可能有所不同，但几个关键步骤是一致的。肿瘤通常在手术切除后不久被接收，许多方案规定从切除到实验室处理的时间应在两小时以内。即使是 Chew 等人，他们能够用切除后长达 48 小时的样本建立细胞系，但也指出从手术切除到实验室处理的时间是建立新的患者来源细胞系的一个决定性因素。实验室处理至少包括机械和酶消化中的一种方法，有时两种方法都使用，目的是将原始组织分解成更小的碎片。解离后，剩余的组织碎片被转移到培养基中并给予时间使其建立细胞系。目前没有一种通用的培养基，不过，在发现基于血清的培养基会导致与原发肿瘤的显著差异后，研究趋势逐渐从基于血清的培养基转向 DMEM 或神经基础培养基。人们在培养基中添加了多种不同的补充剂，希望尽可能保留原始肿瘤的特征，最常用的是表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和 / 或血小板衍生生长因子（PDGF）的组合。

鉴于这些模型使用方便且相关方案相对成熟，患者来源细胞系仍然是最常用的中枢神经系统肿瘤患者来源模型之一。因此，针对患者来源细胞系开发了许多成熟的表征方案，以下列举一些最常见的方法。流式细胞术分析、免疫荧光和免疫组化可用于研究标记物表达；蛋白质免疫印迹可用于蛋白质鉴定、蛋白质定量和基因表达验证；液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS）可用于组蛋白修饰鉴定和定量以及代谢物定量；RNA 测序可用于基因表达谱分析；DNA 测序可用于识别基因变异、拷贝数和甲基化组分析；全基因组测序可用于识别体细胞突变和致病性生殖系突变；聚合酶链式反应（PCR）可用于检测特定的脑肿瘤相关基因；显微摄影可用于表型特征分析。这些不同的成熟方法能够对新型患者来源细胞系进行深入表征。

1. 建立率：患者来源细胞系的建立成功率因肿瘤分级和亚型的不同而有很大差异。由于患者来源细胞系是最常见的模型之一，其建立成功率有大量文献记载。高级别癌症，如胶质母细胞瘤（GBM），更容易建立细胞系，而低级别肿瘤，如低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG），由于生长缓慢，建立细胞系的成功率往往较低。因此，这种模型类型的建立率（指能够持续增殖并反复传代的能力）差异很大（表 1）。Grube 等人发现，他们的 IDH 突变型胶质母细胞瘤细胞系中，47% 在基于血清的培养基中培养时可以进行多次传代。Xie 等人在最初在无血清培养基中培养胶质母细胞瘤细胞系时也取得了类似的成功，传代超过 8 次的成功率为 54%。相比之下，低级别肿瘤的成功率明显较低。当 Xie 等人尝试使用相同的方案扩展到其他肿瘤类型时，他们在 13 个 III 级肿瘤中仅成功建立了 1 个细胞系，在 II 级肿瘤中则一个都没有成功建立（他们甚至没有尝试 I 级肿瘤）。这一发现突出了肿瘤分级与建立细胞系能力之间的强正相关关系。LGG 细胞系建立的失败对研究的多样性和临床相关性产生了负面影响（表 1）。

虽然许多团队从新鲜组织中获取细胞系，但从冷冻保存的组织中创建新的细胞系可以提高组织的可用性并简化工作流程。Mullens 等人观察到，在基于血清的培养基中培养胶质母细胞瘤细胞系时，冷冻保存组织的建立成功率为 59%，新鲜组织为 63%。这种组织的冷冻保存和储存提高了获取患者组织的便利性，且不会显著降低其活力。

儿科病例的细胞系建立率也往往较低。Xu 等人记录了他们在 8 年期间的工作，在此期间他们获取了 161 份儿科肿瘤样本。在这 161 份样本中，仅成功建立了 5 个细胞系，其中只有 3 个能够多次传代，成功率低至不到 2%。与成人肿瘤类似，高级别的儿科肿瘤往往更容易培养，因此在细胞系中占比过高。大多数儿科患者来源细胞系代表髓母细胞瘤，不过，最近手术技术的改进使得曾经无法手术的肿瘤能够进行核心活检，这导致弥漫性内生性桥脑胶质瘤（Diffuse Intrinsic Pontine Glioma，DIPG）和弥漫性中线胶质瘤（Diffuse midline glioma，DMG）细胞系的数量有所增加。尽管如此，从 DIPG 和 DMG 肿瘤获取大肿瘤样本的主要途径仍然是尸检。考虑到对代表性模型的需求，已经建立了几个儿科脑癌细胞系资源库，包括儿童脑肿瘤网络（Children’s Brain Tumor Network）、西雅图儿童医院脑肿瘤资源实验室（Seattle Children’s Brain Tumor Resource Lab）和圣裘德儿童研究医院儿科脑肿瘤平台（St Jude’s Pediatric Brain Tumor Portal）。
2. 时间：Grube 等人报告称，IDH 突变型胶质母细胞瘤细胞系平均在 22 天内建立，倍增时间在 2 到 14 天之间。研究人员通常使用各种成熟的检测方法进行药物敏感性分析，包括（3 -（4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基） - 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐）（MTT）和碘化丙啶检测，可在 48 到 96 小时内获得结果。Grube 等人的方法能够在从建立到功能检测完成的临床相关时间范围内完成。然而，低级别细胞系建立难度较大且代时显著延长，可能无法在相同的相关时间范围内完成功能测试。
3. 成本：建立细胞系后，维持细胞系的成本相对较低，只需要一种专门的生长因子和补充剂混合物。与其他患者来源模型相比，一旦建立，患者来源细胞系具有高通量能力，这进一步降低了成本（表 1）。
4. 基因保真度：患者来源细胞系在基因保真度方面存在重大问题，因为肿瘤细胞在适应塑料培养皿生长时可能发生显著的细胞选择。这促使许多研究人员研究原始组织中哪些基因得以保留（表 1）。Grube 等人发现，长时间的传代会导致基因变化，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的丧失。为了减轻克隆扩增导致的基因漂移，研究人员限制细胞培养的传代次数，以维持更能代表原始肿瘤的细胞系。此外，研究人员发现使用基于血清的培养基会导致基因组和转录组改变，从而导致干细胞样癌细胞的丢失。因此，现在许多研究人员在无血清条件下培养患者来源细胞系。

尽管采取了这些预防措施，但细胞系的增殖仍然只倾向于特定的肿瘤亚群，随着传代次数的增加，肿瘤异质性降低，原始微环境也会丧失（表 1）。Xie 等人对 48 个胶质母细胞瘤细胞系的基因表达进行了分析，发现其中超过 50% 的细胞系在亚型分类上与原始宿主不同。这种差异可能由多种原因造成，但作者认为这是由于肿瘤内异质性的丧失和克隆选择所致。
5. 肿瘤环境捕获：患者来源细胞系无法捕获原始肿瘤的任何固有微环境。与肿瘤细胞一起切除的非恶性细胞不太适合体外培养，当暴露于优化的培养基（如 Grube 等人的基于血清的培养基和其他无血清培养基配方）时，主要是快速增殖的恶性细胞会发生克隆扩增。因此，患者来源细胞系几乎完全由肿瘤细胞组成，尽管巨噬细胞在原发肿瘤中的占比可达 78%。这使得无法评估肿瘤细胞与肿瘤微环境中存在的非肿瘤细胞之间的任何相互作用。此外，患者来源细胞系缺乏外部环境，无法研究肿瘤细胞与非天然微环境之间的新相互作用。为了了解外部微环境的影响，患者来源细胞系必须与另一种模型结合使用。
6. ** 评估